潘恩山，李煜罡，朱曉光

(南方醫(yī)科大學(xué) 1中醫(yī)藥學(xué)院， 2中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院泌尿外科， 廣東 廣州 510315)

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是一種嚴(yán)重威脅男性生命的惡性腫瘤，在中國(guó)的發(fā)病率遠(yuǎn)低于西方國(guó)家，但是近年來(lái)也呈逐年上升的趨勢(shì)[1]。PCa的發(fā)病可能與生活方式、壽命延長(zhǎng)、人口老齡化以及前列腺特異性抗原(prostate-specific antigen，PSA)早期診斷技術(shù)的提高有關(guān)；而PCa患者的死亡則和初診患者已局部進(jìn)展或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移喪失了根治性治療的機(jī)會(huì)相關(guān)[2]，這是因?yàn)镻Ca易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，尤其是骨轉(zhuǎn)移，所以尋找PCa轉(zhuǎn)移相關(guān)基因尤為重要。磷酸甘油酸激酶1(phosphoglycerate kinase 1，PGK 1)是糖酵解通路上的關(guān)鍵酶，催化1，3-二磷酸甘油酸轉(zhuǎn)變成3-磷酸甘油酸，且進(jìn)一步影響DNA的復(fù)制和損傷修復(fù)。在多種惡性腫瘤組織中，包括結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌以及肝癌，PGK1的表達(dá)和腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及預(yù)后明顯相關(guān)[3-6]。研究還表明PGK1和PCa的骨轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但是其在PCa組織中的表達(dá)以及和PCa臨床特征以及預(yù)后的關(guān)系還不清楚。本研究通過(guò)收集PCa和良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia，BPH)患者的前列腺組織，采用免疫組化(immunohistochemistry，IHC)和Western blot法測(cè)定PGK1的表達(dá)，分析PGK1和PCa臨床特征以及預(yù)后的關(guān)系。

材 料 和 方 法

1 樣品收集

本研究對(duì)象為自2013年1月～2014年12月于南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院經(jīng)門(mén)診診治，并在住院部行手術(shù)治療的BPH患者30例和PCa患者132例，所有患者經(jīng)過(guò)醫(yī)院病理科確認(rèn)，并且臨床資料齊全。前列腺病理組織用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，切片厚度4 μm。對(duì)所有患者進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)間為3～48個(gè)月。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 前列腺正常細(xì)胞株RWPE-1和PCa細(xì)胞株LNCaP、DU145和PC3均在含10%胎牛血清、1×105U/L 青霉素 G和100 mg/L 鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，37 °C、5% CO2進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度大約為80%時(shí)用胰酶消化進(jìn)行傳代。

2.2IHC檢測(cè) 常規(guī)石蠟切片厚度4 μm，放入70 ℃烤箱烤片1 h。切片脫蠟，自來(lái)水和蒸餾水沖洗各20 s，確保洗滌充分。采用高溫高壓法修復(fù)抗原。放入3%過(guò)氧化氫水溶液5～10 min，以去除內(nèi)源性過(guò)氧化酶。洗滌。滴加抗PGK1兔多克隆抗體(稀釋度1∶500；Abcam)后37 ℃孵育2 h。甩掉 I 抗，切片放入PBS緩沖液中清洗3次，每次3 min，充分洗滌，防止因 I 抗洗滌不凈引起的非特異性染色。滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG聚合物(稀釋度1∶5 000；北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，37 ℃孵育20 min。DAB顯色5 min。蘇木素復(fù)染細(xì)胞核數(shù)秒。分化、返藍(lán)。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。采用相差顯微鏡拍照(×100和×400)，表達(dá)量分析采用Image-Pro Plus 6.0軟件，對(duì)每張照片進(jìn)行分析得出每張照片陽(yáng)性的積分吸光度(integrated absorbance，IA)。染色結(jié)果根據(jù)每張切片的陽(yáng)性細(xì)胞比例及著色深淺進(jìn)行半定量評(píng)分。染色強(qiáng)度：無(wú)色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色為3分；再按陽(yáng)性細(xì)胞百分率打分：陽(yáng)性細(xì)胞<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞百分比的乘積≤1為陰性，>1為陽(yáng)性。

2.3Western blot檢測(cè) 1 000 r/min離心10 min收集細(xì)胞，吸凈上清后留沉淀。沉淀中直接加入細(xì)胞裂解液，冰上充分裂解。BCA法測(cè)定總蛋白濃度，10% SDS-PAGE分離蛋白，電泳結(jié)束后取出分離膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，加入轉(zhuǎn)膜緩沖液，恒定電流0.5 A轉(zhuǎn)膜2 h。室溫下，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉中封閉1 h。然后將PVDF膜放入10 mL稀釋過(guò)的抗PGK1抗體(1∶2 000)中4 ℃過(guò)夜。去除抗PGK1抗體，30 mL 1×TBST洗膜3次,每次5 min，再加入10 mL稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG聚合物(1∶5 000)，室溫孵育2 h。30 mL 1×TBST洗膜3次,每次5 min，暗室進(jìn)行曝光。灰度采用ImageJ分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組之間比較采用單因素方差分析，多組中兩兩比較采用LSD法；計(jì)數(shù)資料組間對(duì)比采用2檢驗(yàn)。Cox回歸分析進(jìn)行單因素和多因素分析前列腺癌的危險(xiǎn)因素，Kaplan-Meier法分析PGK1陰性表達(dá)和陽(yáng)性表達(dá)組的生存率。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PGK1在PCa組織和細(xì)胞中的表達(dá)

IHC結(jié)果顯示，PCa組織標(biāo)本中都有不同程度的PGK1表達(dá)。PGK1主要表達(dá)于胞漿，偶爾可在核中顯示，呈棕黃色顆粒狀。與BPH組相比，PGK1在PCa組織中的表達(dá)強(qiáng)度顯著提高，見(jiàn)圖1A。與前列腺正常細(xì)胞株RWPE-1相比，PCa細(xì)胞株LNCaP、PC3和DU145中PGK1的表達(dá)顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖1B。

2 PGK1和PCa臨床特征的關(guān)系

PGK1和PCa臨床特征的關(guān)系如表1所示。PGK1和PCa患者的年齡和腫瘤大小的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，而與Gleason評(píng)分、TNM分期、局部浸潤(rùn)、骨轉(zhuǎn)移和血清PSA的表達(dá)有顯著相關(guān)性(P<0.05)。PGK1的高表達(dá)與高Gleason評(píng)分、高TNM分期、局部浸潤(rùn)、發(fā)生骨轉(zhuǎn)移和高血清PSA水平密切相關(guān)。

Figure 1. The expression of PGK1 in the prostate cancer tissues and cells. A: representative images of IHC for obser-ving the expression of PGK1 in the prostate cancer and benign prostatic hyperplasia tissues; B: the relative expression of PGK1 in the prostate cells detected by Western blot.*P<0.05vsthe RWPE-1.

圖1IHC和Westernblot檢測(cè)PGK1在PCa組織和細(xì)胞中的表達(dá)

3 PGK1對(duì)PCa患者的預(yù)后預(yù)測(cè)

根據(jù)IHC結(jié)果將PCa組織分為PGK1表達(dá)陽(yáng)性和陰性2組，其中陰性表達(dá)組為54例，陽(yáng)性表達(dá)組為78例。用生存曲線分析PCa患者的生存時(shí)間和PGK1表達(dá)的關(guān)系，結(jié)果如示，Kaplan-Meier分析表明PGK1的陽(yáng)性表達(dá)和陰性表達(dá)組生存時(shí)間差異顯著(P=0.009)，PGK1表達(dá)陽(yáng)性預(yù)示預(yù)后不良，見(jiàn)圖2。進(jìn)一步采用單變量和多變量Cox分析，確定PGK1的表達(dá)和表1的臨床病理參數(shù)是否為前列腺癌患者生存的獨(dú)立危險(xiǎn)參數(shù)，結(jié)果如表2所示。單變量Cox分析表明Gleason評(píng)分、TNM分期、局部浸潤(rùn)、骨轉(zhuǎn)移、血清PSA水平及PGK1表達(dá)是影響PCa患者生存的危險(xiǎn)因素；進(jìn)一步采用多變量Cox分析表明骨轉(zhuǎn)移、血清PSA水平和PGK1表達(dá)是PCa患者生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

表1PGK1和PCa的臨床特征的關(guān)系
Table 1. The relationship between PGK1 and clinicopathological features of PCa

Clinicopathological featurenPGK1 expression+- 2PAge0.6780.410 ≤60471730 >60853748Tumor size (cm)1.9810.159 <5782850 ≥5542628Gleason grade9.2540.002 ≤7673631 >7651847TNM stage5.8230.016 Ⅰ+Ⅱ793940 Ⅲ+Ⅳ531538Invasion5.4840.019 Yes 842856 No 482622Bone metastasis9.4340.002 Yes36729 No964749Serum PSA (μg/L)29.7000.000 ≤1039309 >10932469

Figure 2. Evaluation of the influence of PGK1 on the prognosis of prostate cancer patients by survival curves.

圖2生存曲線評(píng)估PGK1對(duì)PCa患者預(yù)后的影響

討 論

PGK1是糖酵解通路上的關(guān)鍵酶，催化1，3-二磷酸甘油酸轉(zhuǎn)變成3-磷酸甘油酸，進(jìn)一步影響DNA的復(fù)制和損傷修復(fù)。PGK-1和腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及耐藥性有著密切關(guān)系。研究表明，PGK1的K323 位點(diǎn)乙?；軌蛴绊懜伟㏄CAF(p300/CBP-associated factor)和SIRT7(sirtuin 7)的表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增長(zhǎng)，從而促進(jìn)肝癌的發(fā)生和發(fā)展[3]。在結(jié)腸癌中，PGK1在轉(zhuǎn)移患者組織中的表達(dá)比未轉(zhuǎn)移患者明顯升高，表明PGK1和結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4]。全基因組表達(dá)譜芯片篩查分析發(fā)現(xiàn)PGK1在卵巢癌的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中具有重要作用[7]；PGK1還能夠促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的遷移和侵襲，促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的化療耐藥[8-9]。以往研究還表明PGK1在PCa組織中的表達(dá)明顯上升，高表達(dá)的PGK1能夠誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化，抑制破骨細(xì)胞形成，促進(jìn)PCa的骨轉(zhuǎn)移[10]。PGK1在PCa相關(guān)的基質(zhì)細(xì)胞也高表達(dá)；基質(zhì)細(xì)胞高表達(dá)PGK1釋放到腫瘤微環(huán)境中能夠刺激CXCL12-CXCR4信號(hào)通路，促進(jìn)MMP-2和MMP-3蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)PCa細(xì)胞的遷移和侵襲[11]。本研究表明PGK1在PCa組織和細(xì)胞中的表達(dá)明顯上升，而且PGK1的表達(dá)與PCa的Gleason評(píng)分、TNM分期、局部浸潤(rùn)、骨轉(zhuǎn)移和血清PSA水平具有顯著相關(guān)性，和以往研究相似。

表2單變量和多變量COX分析前列腺癌患者臨床特征對(duì)總生存率的影響
Table 2. The effects of clinicopathological parameters on overall survival of PCa patients evaluated by univariate and multivariate Cox analysis

Clinicopathological parameterUnivariate analysisMultivariate analysisRisk ratio95% CIPRisk ratio95% CIPAge 1.4850.722～3.0540.283Tumor size0.7960.386～1.6430.538Gleason grade2.4881.731～7.0280.0111.3450.306～2.8160.077TNM stage2.3811.506～7.5920.0130.9130.191～1.9690.116Invasion2.4941.114～3.5530.0311.9190.411～8.9690.407Bone metastasis3.3392.316～10.615<0.0012.8501.382～3.4760.011Serum PSA2.7561.459～4.1140.0112.0261.493～2.7480.005PGK1 expression5.4392.543～11.633<0.0014.1182.191～9.442<0.001

CI: confidence interval.

PGK1和腫瘤的預(yù)后不良明顯相關(guān)，可以作為腫瘤的預(yù)后預(yù)測(cè)基因。在乳腺癌中PGK1表達(dá)和乳腺癌癌旁組織相比明顯上升，和患者的總生存率密切相關(guān)[12]。Lu等[13]研究表明PGK1能夠作為膽囊癌的預(yù)后預(yù)測(cè)蛋白；Zieker等[14]發(fā)現(xiàn)在胃癌中PGK1高表達(dá)，PGK1可以作為PCa預(yù)后不良預(yù)測(cè)的標(biāo)志物。本研究表明Gleason評(píng)分、TNM分期、局部浸潤(rùn)、骨轉(zhuǎn)移、血清PSA水平及PGK1表達(dá)是影響PCa患者生存的危險(xiǎn)因素，而多變量COX分析表明骨轉(zhuǎn)移、血清PSA水平和PGK1表達(dá)是PCa患者生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。進(jìn)一步研究表明高表達(dá)的PGK1與PCa的預(yù)后不良明顯相關(guān)，與PGK1在其它腫瘤中的預(yù)后預(yù)測(cè)作用相似。

總之，PGK1是PCa患者生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，能夠作為PCa的預(yù)后預(yù)測(cè)標(biāo)志物。但是由于文中收集的樣本數(shù)較少，下一步將收集大樣本進(jìn)行調(diào)查驗(yàn)證。

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1] Torre LA, Bray F, Siegel RL, et al. Global cancer statistics, 2012[J]. CA Cancer J Clin, 2015, 65(2):87-108.

[2] Chen W, Zheng R, Zeng H, et al. Annual report on status of cancer in China, 2011[J]. Chin J Cancer Res, 2015, 27(1):2-12.

[3] Hu H, Zhu W, Qin J, et al. Acetylation of PGK1 promotes liver cancer cell proliferation and tumorigenesis[J]. Hepatology, 2017, 65(2):515-528.

[4] Ahmad SS, Glatzle J, Bajaeifer K, et al. Phosphoglyce-rate kinase 1 as a promoter of metastasis in colon cancer[J]. Int J Oncol, 2013, 43(2):586-590.

[5] Shashni B, Sakharkar KR, Nagasaki Y, et al. Glycolytic enzymes PGK1 and PKM2 as novel transcriptional targets of PPARγ in breast cancer pathophysiology[J]. J Drug Target, 2013, 21(2):161-174.

[6] Tang SJ, Ho MY, Cho HC, et al. Phosphoglycerate kinase 1-overexpressing lung cancer cells reduce cyclooxygenase 2 expression and promote anti-tumor immunityinvivo[J]. Int J Cancer, 2008, 123(12):2840-2848.

[7] 李典鶴， 黃昌男， 李 奇. 基于癌癥基因組圖譜篩查卵巢漿液性囊腺癌相關(guān)基因[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2016, 32(12):2276-2281.

[8] 丁 浩， 周 濤， 成宜軍， 等. 下調(diào)磷酸甘油酸激酶1增強(qiáng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的放射敏感性[J]. 臨床神經(jīng)外科雜志, 2014, 21(5):321-325.

[9] Cheng YJ, Ding H, Du HQ, et al. Downregulation of phosphoglycerate kinase 1 by shRNA sensitizes U251 xe-nografts to radiotherapy[J]. Oncol Rep, 2014, 32(4):1513-1520.

[10] Jung Y, Shiozawa Y, Wang J, et al. Expression of PGK1 by prostate cancer cells induces bone formation[J]. Mol Cancer Res, 2009, 7(10):1595-1604.

[11] Wang J, Ying G, Jung Y, et al. Characterization of phosphoglycerate kinase-1 expression of stromal cells derived from tumor microenvironment in prostate cancer progression[J]. Cancer Res, 2010, 70(2):471-480.

[12] Sun S, Liang X, Zhang X, et al. Phosphoglycerate kinase-1 is a predictor of poor survival and a novel prognostic biomarker of chemoresistance to paclitaxel treatment in breast cancer[J]. Br J Cancer, 2015, 112(8):1332-1339.

[13] Lu W, Gao J, Yang J, et al. Down-regulated phosphoglycerate kinase 1 expression is associated with poor prognosis in patients with gallbladder cancer [J]. Medicine (Baltimore), 2015, 94(49):e2244.

[14] Zieker D, Konigsrainer I, Traub F, et al. PGK1 a potential marker for peritoneal dissemination in gastric cancer[J]. Cell Physiol Biochem, 2008, 21(5-6):429-436.