朱彬蔚，卞蓉蓉，陳冬平，梅長(zhǎng)林

(第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)征醫(yī)院腎內(nèi)科， 上海 200001)

急性腎損傷是臨床上常見(jiàn)的一種綜合征，缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)是引起該病的一個(gè)重要因素[1]。近些年來(lái)，在臨床上常采用導(dǎo)管術(shù)、溶栓療法和腎臟移植等新技術(shù)重新恢復(fù)缺血腎組織血流，但卻引起腎臟IRI的發(fā)生[2]。腎小管上皮細(xì)胞(renal tubular epithelial cells，RTEC)對(duì)膿毒血癥、中毒和缺血缺氧等損傷因素較敏感，缺氧損傷是引起各種腎臟疾病發(fā)生的重要原因，主要的病變是小管上皮細(xì)胞的凋亡和壞死，而小管上皮細(xì)胞的增殖、去分化及再分化是損傷后修復(fù)的基礎(chǔ)[3]。目前已發(fā)現(xiàn)在腎臟缺氧損傷后有多種熱點(diǎn)分子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子和細(xì)胞間黏附因子等參與了修復(fù)過(guò)程，但卻不是有效的治療手段[4]。因此，尋找有效的急性腎損傷治療靶點(diǎn)具有重要意義。同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白激酶2(homeo-domain-interacting protein kinase 2，HIPK2)是HIPK家族中的一員，是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，參與調(diào)控基因表達(dá)，受到信號(hào)誘導(dǎo)后激活，在細(xì)胞增殖和凋亡等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中有重要作用[5]。近些年的研究表明，HIPK2是一個(gè)腫瘤抑制基因，可影響肝癌和結(jié)直腸癌等多種腫瘤的生物學(xué)特性[6-7]；近期研究報(bào)道，HIPK2是腎臟纖維化過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其高度活躍時(shí)可引起腎臟纖維化的發(fā)生[8]。而HIPK2在急性腎損傷中的作用還未清楚。因此，本研究通過(guò)將靶向HIPK2的小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)轉(zhuǎn)染大鼠腎近曲小管上皮細(xì)胞株NRK-52E，并進(jìn)行缺氧復(fù)氧(hypoxia and reoxyge-nation，H/R)處理，檢測(cè)細(xì)胞增殖和凋亡情況，并研究其作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)材料

大鼠腎近曲小管上皮細(xì)胞株NRK-52E購(gòu)自ATCC；胎牛血清和胰蛋白酶均購(gòu)自Gibco； DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone； LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自Invitrogen； CCK-8試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；Annexin V-FITC/碘化丙啶(propidium iodide，PI)細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自南京凱基生物技術(shù)公司；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)試劑盒購(gòu)自Nerck Millipore；Fluo-3/AM購(gòu)自Biotium；兔抗人cleaved Caspase-3和caspase-12多抗、鼠抗人Bcl-2單抗、鼠抗人Bax單抗、兔抗人磷酸化Janus激酶2(phosphorylated Janus kinase 2，p-JAK2)單抗和兔抗人磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3，p-STAT3)單抗均購(gòu)自Abcam；酶標(biāo)儀購(gòu)自Bio-Rad；流式細(xì)胞儀購(gòu)自BD。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組 取出凍存在液氮罐中的NRK-52E細(xì)胞，37 ℃水浴快速溶解，溶解后細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2及95% O2的培養(yǎng)箱中用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，換液去除未貼壁細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%以上，用胰蛋白消化后進(jìn)行傳代。細(xì)胞達(dá)80%融合后換成不含胎牛血清的高糖培養(yǎng)液同步化培養(yǎng)24 h，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(control組)、陰性對(duì)照組(HIPK2-NC組)、H/R組和HIPK2-siRNA+H/R組。

2.2HIPK2-siRNA轉(zhuǎn)染NRK-52E細(xì)胞效率的檢測(cè) HIPK2-siRNA轉(zhuǎn)染NRK-52E細(xì)胞參照LipofectamineTM2000說(shuō)明書(shū)。取轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞中蛋白，BCA試劑盒定量蛋白，制備5%的濃縮膠和12%的分離膠，取40 μg蛋白樣品與上樣緩沖液充分混勻，100 ℃煮沸變性5 min，行SDS-PAGE分離(濃縮膠電壓為80～100V，電泳約30 min;分離膠電壓120 V，電泳約1.5 h)，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉， I 抗孵育(HIPK2和內(nèi)參照GAPDH皆按照1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體 II 抗(1∶2 000稀釋)，洗膜，加入配置好的化學(xué)發(fā)光試劑，室溫孵育2 min，曝光、顯影、定影。Quantity One軟件對(duì)蛋白灰度值進(jìn)行分析。

2.3缺氧復(fù)氧細(xì)胞模型的制備 取轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，缺氧制備前將培養(yǎng)液換成磷酸鹽緩沖液溶液，置于含有體積分?jǐn)?shù)為1% O2、4% CO2及95% N2混合氣體缺氧的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1 h后，換為正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于5% CO2及95% O2的培養(yǎng)箱內(nèi)2 h，收集細(xì)胞。

2.4CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 各組細(xì)胞活力采用CCK-8法檢測(cè)。每孔加入CCK-8液10 μL，37 ℃孵育4 h，酶標(biāo)儀以波長(zhǎng)490 nm測(cè)定各孔的吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以吸光度值反映細(xì)胞活力。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。將5×105個(gè)NRK-52E細(xì)胞接種于6孔板中，按照前面分組處理后，胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，離心，棄掉上清，預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞，離心，棄上清，加入結(jié)合緩沖液500 μL重懸細(xì)胞，加入Annexin V-FITC 5 μL，充分混勻后，置于4 ℃避光環(huán)境中孵育15 min，再加入PI 5 μL，置于室溫避光環(huán)境中5～15 min，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6Ca2+熒光強(qiáng)度檢測(cè) 采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)游離的Ca2+熒光強(qiáng)度。胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞，離心，磷酸鹽緩沖液洗滌2遍，細(xì)胞中加入1 μmol/L的鈣敏感熒光探針Fluo-3/AM，充分振蕩混合均勻，置于37 ℃避光條件下孵育45 min，磷酸鹽緩沖液洗滌除去沒(méi)有結(jié)合的燃料，繼續(xù)15 min孵育后送檢(1 000個(gè)細(xì)胞)。Fluo-3/AM的發(fā)射波長(zhǎng)及激發(fā)波長(zhǎng)分別為526 nm和488 nm。細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度通過(guò)熒光強(qiáng)度反映。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7Western blotting檢測(cè)蛋白水平 細(xì)胞內(nèi)增殖相關(guān)蛋白Ki67、凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3、 caspase-12、Bcl-2、Bax及JAK2/STAT3信號(hào)通路p-JAK2和p-STAT3蛋白水平的檢測(cè)參照方法2.2進(jìn)行。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組差異比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 HIPK2-siRNA轉(zhuǎn)染NRK-52E細(xì)胞效果

HIPK2-siRNA組HIPK2的蛋白表達(dá)顯著低于control組(P<0.05)，而在HIPK2-NC組HIPK2的蛋白表達(dá)與control組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖1。這說(shuō)明轉(zhuǎn)染HIPK2-siRNA可顯著降低HIPK2的表達(dá)。

2 HIPK2-siRNA轉(zhuǎn)染可促進(jìn)H/R誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞活力

H/R組的細(xì)胞活力顯著低于control組(P<0.05)，而HIPK2-siRNA+H/R組細(xì)胞活力顯著高于H/R組(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

3 HIPK2-siRNA轉(zhuǎn)染可抑制H/R誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞凋亡

H/R組細(xì)胞凋亡率顯著高于control組(P<0.05)，而HIPK2-siRNA+H/R組細(xì)胞凋亡率顯著低于H/R組(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

4 HIPK2-siRNA轉(zhuǎn)染可降低H/R誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞的Ca2+熒光強(qiáng)度

H/R組Ca2+熒光強(qiáng)度值顯著高于control組(P<0.05)，而HIPK2-siRNA+H/R組Ca2+熒光強(qiáng)度值顯著低于H/R組(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

Figure 1. The protein expression of HIPK2 after HIPK2-siRNA was transfected into NRK-52E cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖1HIPK2-siRNA轉(zhuǎn)染NRK-52E細(xì)胞后HIPK2的蛋白表達(dá)

Figure 2. The effect of HIPK2-siRNA transfection on the viability of NRK-52E cells induced by H/R. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH/R group.

圖2HIPK2-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)H/R誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞活力的影響

5 HIPK2-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)H/R誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

H/R組的Ki67和Bcl-2蛋白表達(dá)顯著低于control組(P<0.05)，cleaved caspase-3、 caspase-12和Bax的蛋白表達(dá)顯著高于control組(P<0.05)；而HIPK2-siRNA+H/R組Ki67和Bcl-2蛋白表達(dá)顯著高于H/R組(P<0.05)，cleaved caspase-3、caspase-12和Bax的蛋白表達(dá)顯著低于H/R組(P<0.05),見(jiàn)圖5。

6 HIPK2-siRNA轉(zhuǎn)染可下調(diào)H/R誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞JAK2/STAT3信號(hào)通路蛋白的磷酸化水平

H/R組的p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)均顯著高于control組(P<0.05)，而HIPK2-siRNA+H/R組的p-JAK2和p-STAT3蛋白水平顯著低于H/R組(P<0.05),見(jiàn)圖6。

Figure 3. The effect of HIPK2-siRNA transfection on the apoptosis of NRK-52E cells induced by H/R. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH/R group.

圖3HIPK2-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)H/R誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞凋亡的影響

Figure 4. The effect of HIPK2-siRNA transfection on Ca2+fluorescence intensity of NRK-52E cells induced by H/R. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH/R group.

圖4HIPK2-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)H/R誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞Ca2+熒光強(qiáng)度的影響

討 論

腎IRI是引起缺血性腎衰竭的一個(gè)主要原因，如何有效防治腎IRI是國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)[9]。腎IRI的發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，RTEC凋亡是其發(fā)生的一個(gè)重要機(jī)制，主要與鈣超載、氧自由基增多和能量代謝障礙等因素有密切聯(lián)系[10]，因此研究有效的腎臟損傷治療方法尤為重要。HIPKs家族分為HIPK1、HIPK2和HIPK3。小鼠HIPK2基因定位于6B染色體上，人類(lèi)HIPK2基因定位于7q32～34，是一種細(xì)胞核內(nèi)的絲蘇氨酸蛋白激酶。近些年的研究發(fā)現(xiàn)，HIPK2是一個(gè)有多種功能潛在的腫瘤抑制因子，可通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞中一些關(guān)鍵分子通路，而抑制腫瘤生長(zhǎng)及使藥物敏感性增強(qiáng)[11-12]。隨著對(duì)HIPK2研究的深入，其在腎臟中的作用受到廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，HIPK2可通過(guò)調(diào)節(jié)Notch、p53和Smad3等通路在腎臟中發(fā)揮促炎和纖維化作用[13-14]。最新研究發(fā)現(xiàn)，HIPK2表達(dá)的抑制可減緩腎臟纖維化的進(jìn)程，可作為腎臟纖維化治療的靶點(diǎn)[15]。但關(guān)于HIPK2在腎損傷中的研究不多。

Figure 5. The effect of HIPK2-siRNA transfection on the expression of proliferation-and apoptosis-related proteins in the NRK-52E cells induced by H/R. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH/R group.

圖5HIPK2-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)H/R誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞增殖及凋亡蛋白表達(dá)的影響

本研究將靶向HIPK2的siRNA轉(zhuǎn)染NRK-52E細(xì)胞，細(xì)胞中HIPK2的表達(dá)明顯降低，說(shuō)明轉(zhuǎn)染后可明顯抑制HIPK2表達(dá)。細(xì)胞經(jīng)過(guò)H/R處理，通過(guò)CCK-8法及流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)細(xì)胞活力及凋亡情況，發(fā)現(xiàn)H/R處理細(xì)胞活力明顯降低，凋亡率增加，而HIPK2-siRNA+H/R處理可改善這一現(xiàn)象。這提示沉默HIPK2對(duì)急性腎損傷的腎小管起到保護(hù)作用。Ki67是一種與增殖細(xì)胞相關(guān)的核抗原，是檢測(cè)細(xì)胞增殖活性比較準(zhǔn)確、理想、可靠的抗原，已在多種疾病的研究和探討中得到廣泛的應(yīng)用[16-18]。細(xì)胞凋亡信號(hào)有線(xiàn)粒體和死亡受體途徑2條經(jīng)典的傳導(dǎo)通路。近些年的研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)可引起細(xì)胞凋亡啟動(dòng)，是一條新的引起細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)通路，可特異性使caspase-12激活，而caspase-12可裂解caspase-3等一些下游效應(yīng)蛋白酶，最終引起細(xì)胞凋亡[19-20]。研究發(fā)現(xiàn)，H/R刺激腎上皮細(xì)胞可觸發(fā)ERS，引起caspase-12的激活[21]。Ca2+可參與多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，是細(xì)胞內(nèi)正常生理功能維持的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，研究發(fā)現(xiàn)，I/R損傷可增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+，活化caspase-12，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[22]。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族的2個(gè)重要蛋白，Bcl-2/Bax的比例是引起細(xì)胞凋亡啟動(dòng)的關(guān)鍵因素，Bcl-2/Bax比率上調(diào)可使細(xì)胞凋亡抑制，Bcl-2/Bax比率下調(diào)可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增多[23]。研究發(fā)現(xiàn)，在腎臟疾病中Bcl-2和Bax發(fā)揮至關(guān)重要的作用[24]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沉默HIPK2促進(jìn)H/R處理的NRK-52E細(xì)胞增殖的機(jī)制是上調(diào)Ki67，抑制凋亡的機(jī)制是上調(diào)Bcl-2表達(dá)，下調(diào)caspase-12、cleaved caspase-3和Bax表達(dá)。

Figure 6. The effect of HIPK2-siRNA transfection on JAK2/STAT3 signaling in NRK-52E cells induced by H/R. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsH/R group.

圖6HIPK2-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)H/R誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞JAK2/STAT3信號(hào)的影響

JAK2/STAT3信號(hào)通路參與細(xì)胞的增殖、凋亡、分化、免疫調(diào)節(jié)和遷移等生理過(guò)程，正常RTEC有低水平活化，主要介導(dǎo)修復(fù)和增生[25-26]。近些年在腎臟疾病中的調(diào)控作用受到廣泛關(guān)注，已被證實(shí)其與足細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞等有密切關(guān)系[27]。JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活可引起RTEC凋亡，可能參與乙肝病毒對(duì)腎組織直接損傷的致病機(jī)制[28]；抑制JAK2/STAT3信號(hào)可降低RTEC的轉(zhuǎn)分化[29]；H/R條件可激活JAK2/STAT3，而抑制其活性后對(duì)RTEC起保護(hù)作用[30]。本研究結(jié)果顯示，HIPK2表達(dá)的抑制可下調(diào)NRK-52E細(xì)胞JAK2/STAT3信號(hào)表達(dá)，這與前人在腎臟中的作用研究是一致的。

綜上所述，抑制HIPK2基因可促進(jìn)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的NRK-52E腎小管上皮細(xì)胞生長(zhǎng)，下調(diào)JAK2/STAT3信號(hào)通路，降低凋亡率，上調(diào)Ki67，從而上調(diào)Bcl-2表達(dá)，同時(shí)下調(diào)caspase-12、caspase-3和Bax表達(dá)。HIPK2基因可能是急性腎損傷治療的一個(gè)新的靶點(diǎn)。但本研究還未進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究，存在一定的局限性，這也是我們后期實(shí)驗(yàn)研究的重點(diǎn)。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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