李健玲, 徐 卉, 張賀平, 付詠梅, 王彥平, 王華東, 陸大祥△, 戚仁斌△

(暨南大學(xué) 1附屬第一醫(yī)院麻醉科， 2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系， 國(guó)家中醫(yī)藥管理局病理生理實(shí)驗(yàn)室， 廣東 廣州 510632)

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種由多源性病因引起的進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，其典型特征是神經(jīng)病理和神經(jīng)化學(xué)的改變，可在老年前期起病，但老年期的發(fā)病率更高。根據(jù)國(guó)際阿爾茨海默病聯(lián)合會(huì)發(fā)布的報(bào)告，目前全球約有4 700萬(wàn)阿爾茨海默病患者；美國(guó)阿爾茨海默病協(xié)會(huì)2017年度報(bào)告，全美大約已有550萬(wàn)患者，美國(guó)每66秒出現(xiàn)一位AD患者，到2050年，這個(gè)時(shí)間將縮短至33秒[1]?！丁笆濉眹?guó)家老齡事業(yè)發(fā)展和養(yǎng)老體系建設(shè)規(guī)劃》預(yù)測(cè)，到2020年，全國(guó)60歲以上老年人口將增加到2.55億人左右，占總?cè)丝诒戎靥嵘?7.8%左右，2050年更將高達(dá)4.37億。流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，我國(guó)65歲以上老年人AD的罹患率約為老年人口的4.8%左右，并且在以每年5%～7%的速度增長(zhǎng)，保守估計(jì)我國(guó)已有AD患者約600萬(wàn)～700萬(wàn)[2]。以AD為代表的老年病日益成為家庭和社會(huì)的沉重負(fù)擔(dān)，防治AD不僅是一個(gè)高難度的醫(yī)學(xué)問(wèn)題，也是一個(gè)重大的社會(huì)問(wèn)題。本課題組在先前的研究中發(fā)現(xiàn)中藥Q0409篩選方具有較好的改善小鼠學(xué)習(xí)記憶的能力[3]。在本研究中，我們選用AD模型SAM-P/8快速老化系小鼠為研究對(duì)象，運(yùn)用中藥Q0409篩選方進(jìn)行治療性研究，觀察該方對(duì)AD疾病模型的治療作用及可能機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康4月齡SAM-P/8小鼠50只(雌29只，雄21只)，體重(20±5) g；健康4月齡SAM-R/1小鼠21只(雌12只,雄9只)，體重(20±5) g，由北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(京)2002-0001]。健康4月齡昆明小鼠20只，雄雄各半，體重(20±5) g，由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(粵)2003-0002;粵監(jiān)證字為2006A018]。

2 主要試劑與儀器

中藥Q0409篩選方選用人參和遠(yuǎn)志免煎顆粒劑(三九醫(yī)藥)；石杉?jí)A甲(huperzine A, HupA)片(每片50 μg,上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司)；乙酰膽堿酯酶(acetyl cholinesterase，AChE)檢測(cè)試劑盒和蛋白定量(雙縮脲法)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；I抗為兔抗β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein,Aβ)1-42親和純化的多克隆抗體(Chemicon International)；II抗為HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)；濃縮型3,3’-二氨基聯(lián)苯胺(3,3’-diaminobenzidine, DAB)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。視頻自動(dòng)跟蹤Morris水迷宮(成都泰盟科技有限公司)；Lambda 45紫外/可見(jiàn)光連續(xù)光譜分光光度計(jì)(Perkin Elmer)；BX-51數(shù)碼照相顯微鏡(Olympus)。

3 藥物配制

3.1中藥Q0409篩選方溶液的配制 人參和遠(yuǎn)志的中藥免煎顆粒劑用雙蒸水配制成不同配伍的中藥溶液(具體藥物劑量和濃度依據(jù)《中藥藥理學(xué)》[4]確定，遠(yuǎn)志286 g/L，人參238 g/L)。

3.2石杉?jí)A甲溶液的配制 HupA人的劑量為4.29 μg/kg，根據(jù)人與小鼠體表面積換算公式，得出小鼠的劑量約為0.03 μg/g，HupA的劑量為每片含藥50 μg，加入12 mL雙蒸水，終濃度約為4.2 mg/L。

4 實(shí)驗(yàn)方法

4.1動(dòng)物飼養(yǎng)和給藥 小鼠每天自由飲食、飲水，并定時(shí)換墊料，以維持小鼠生活環(huán)境清潔衛(wèi)生。同時(shí)每天定時(shí)給各組小鼠灌胃相應(yīng)的雙蒸水、中藥和石杉?jí)A甲溶液。

4.2動(dòng)物分組 實(shí)驗(yàn)前，對(duì)小鼠進(jìn)行初步篩選，根據(jù)游泳找到Morris水迷宮平臺(tái)的潛伏期，按隨機(jī)區(qū)組方法分成5組[5]：(1)昆明小鼠對(duì)照組，即正常對(duì)照組(control組，n=20)；(2)SAM-R/1小鼠對(duì)照組(SAM-R/1組，n=21)；(3)SAM-P/8小鼠組，即疾病模型組(SAM-P/8組,n=17)；(4)中藥Q0409篩選方治療組(SAM-P/8+Q0409,n=16)；(5)石杉?jí)A甲治療組，即陽(yáng)性藥物對(duì)照組(SAM-P/8+HupA組，n=17)。其中，中藥治療組的小鼠每天灌胃相應(yīng)劑量中藥溶液，對(duì)照組和疾病模型組的小鼠灌胃相同體積的雙蒸水，陽(yáng)性藥物對(duì)照組的小鼠灌胃相應(yīng)劑量石杉?jí)A甲溶液，連續(xù)60 d(即從4月齡到6月齡)。第61～65天每天先灌胃相應(yīng)劑量中藥、石杉?jí)A甲溶液和雙蒸水(劑量同前)，1 h后，開(kāi)始進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。

4.3Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 第61～65天，進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)分為2個(gè)過(guò)程：定位航行(na-vigation training)和空間探索(spatial probe training)實(shí)驗(yàn)[6]。(1)定位航行實(shí)驗(yàn)：用于檢測(cè)動(dòng)物的學(xué)習(xí)和記憶獲得能力。第61～64天，將平臺(tái)置于東北象限的中央，每天分別從東西南北4個(gè)入水點(diǎn)將動(dòng)物背向平臺(tái)放入水中，記錄動(dòng)物游上平臺(tái)所需時(shí)間即逃避潛伏期，歷時(shí)4 d，具體方法與篩選動(dòng)物時(shí)相同；(2)空間探索實(shí)驗(yàn)：用于測(cè)量動(dòng)物對(duì)平臺(tái)位置的記憶保持能力。最后 1 d，即第65天，撤除平臺(tái)，任選1個(gè)入水點(diǎn)將動(dòng)物背向平臺(tái)放入水中，讓動(dòng)物自由游泳60 s，記錄60 s內(nèi)動(dòng)物穿越原平臺(tái)區(qū)的次數(shù)及動(dòng)物在各象限的游泳時(shí)間。所有行為學(xué)測(cè)試過(guò)程中，保持房間安靜，光線(xiàn)柔和，室內(nèi)參照物位置不變。

4.4小鼠腦海馬組織勻漿 第65天，水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，立即處死各組剩余小鼠，剝離腦組織中的海馬，置玻璃勻漿器中加入預(yù)冷生理鹽水制成10%(g/mL)腦海馬組織勻漿，待測(cè)定腦海馬組織勻漿中乙酰膽堿酯酶的活性。

4.5小鼠大腦的固定 第65天，水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組取雌、雄小鼠，由心臟用4%多聚甲醛固定液灌注固定，約20～30 min后，待小鼠全身硬化時(shí)，取出小鼠的大腦組織，置4%多聚甲醛固定液中，鉛筆標(biāo)記，并放入冰箱冷藏保存(4 ℃)備用。

4.6生化檢測(cè) 按試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法測(cè)定各組小鼠腦海馬組織勻漿中乙酰膽堿酯酶的活性。

4.7小鼠海馬組織Aβ蛋白的免疫組化染色 石蠟切片脫蠟和水化后，用PBS(pH 7.4)沖洗3次，每次3 min。根據(jù)抗Aβ抗體的說(shuō)明書(shū)要求和試片的結(jié)果，無(wú)需對(duì)組織抗原進(jìn)行修復(fù);每張切片加1滴或50 μL 3%過(guò)氧化氫，室溫下孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。PBS沖洗3次，每次3 min，除去PBS液;每張切片加約40～50 μL的 抗Aβ抗體(1∶10稀釋?zhuān)K濃度為 50 mg/L)，室溫下孵育放入冰箱冷藏室4 ℃過(guò)夜。24 h后，取出冷藏抗原-抗體反應(yīng)的玻片，用PBS沖洗3次，每次3～5 min。除去PBS液，每張切片加1滴或50 μL即用型Max VisionTM試劑(II抗為goat anti-rabbit IgG)，室溫下孵育10～15 min。PBS沖洗3次,每次3 min,除去PBS液，每張切片加2滴新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察3～5 min;自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染，PBS或自來(lái)水沖洗返藍(lán)，切片經(jīng)過(guò)梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，蓋上蓋玻片，中性樹(shù)膠封固;待封固好的中性樹(shù)膠干燥后，取片于顯微鏡下觀察拍照，采用圖像分析軟件Image-Pro Plus 3.0進(jìn)行分析。為防止可能出現(xiàn)的假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程設(shè)置陽(yáng)性與陰性對(duì)照。陰性對(duì)照即在染色過(guò)程中不加 I 抗，以PBS溶液代替，其余步驟完全相同。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

小鼠Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用重復(fù)測(cè)量方差分析；小鼠Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果、小鼠腦海馬組織勻漿中乙酰膽堿酯酶活性及Aβ沉積陽(yáng)性面積等數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 中藥Q0409篩選方對(duì)小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)行為學(xué)指標(biāo)的影響

1.1各組小鼠Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由圖1可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)4 d尋找隱匿平臺(tái)的訓(xùn)練，5組動(dòng)物的逃避潛伏期均下降(P<0.05)。昆明小鼠對(duì)照組與SAM-R/1對(duì)照組之間比較，逃避潛伏期的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；而這2個(gè)組的逃避潛伏期均短于SAM-P/8組(P<0.05)，提示疾病模型是可靠的；與SAM-P/8組比較，SAM-P/8+Q0409組和SAM-P/8+石杉?jí)A甲組的逃避潛伏期均縮短(P<0.05),提示SAM-P/8+Q0409組的學(xué)習(xí)記憶能力有所改善。

Figure 1. The avoiding latency of mice in the navigation training every day. Mean±SD.*P<0.05vsSAM-P/8 group.

圖1小鼠在定位航行實(shí)驗(yàn)中逃避潛伏期的比較

1.2各組小鼠Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較 經(jīng)過(guò)4 d尋找隱匿平臺(tái)的學(xué)習(xí)訓(xùn)練，第5天進(jìn)行記憶實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。昆明小鼠對(duì)照組與SAM-R/1對(duì)照組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；而這2個(gè)組的目標(biāo)象限停留時(shí)間均長(zhǎng)于SAM-P/8組，且經(jīng)過(guò)平臺(tái)次數(shù)均多于SAM-P/8組(P<0.05)，提示疾病模型是可靠的；與SAM-P/8組比較，SAM-P/8+Q0409組和SAM-P/8+石杉?jí)A甲組的目標(biāo)象限停留時(shí)間均延長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)平臺(tái)次數(shù)均明顯增多(P<0.01)。

表1小鼠第5天游泳經(jīng)過(guò)平臺(tái)次數(shù)及目標(biāo)象限停留時(shí)間
Table 1. The frequencies of mice passing through the platform and the stay time in the aim quadrant of the mice on the 5th day (Mean±SD)

GroupnStay time in the aimquadrant (s)Frequency of mice passing through the platformControl2014.14±4.13△2.05±0.30△SAM-R/12113.40±5.54△2.00±0.29△SAM-P/8179.92±4.560.63±0.17SAM-P/8+Q04091614.89±5.60△△1.94±0.30△△SAM-P/8+HupA1713.58±6.81△1.88±0.30△

△P<0.05,△△P<0.01vsSAM-P/8 group.

2 中藥Q0409篩選方對(duì)小鼠海馬組織勻漿乙酰膽堿酯酶活性的影響

由圖2可見(jiàn)，昆明小鼠對(duì)照組與SAM-R/1對(duì)照組之間海馬組織勻漿AChE活性的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；這2個(gè)組海馬組織勻漿AChE活性明顯低于與SAM-P/8組(P<0.05)，提示疾病模型是可靠的；與SAM-P/8組比較，SAM-P/8+Q0409組和SAM-P/8+石杉?jí)A甲組海馬組織勻漿AChE活性均明顯降低(P<0.01)。

Figure 2. The activity of AChE in the hippocampus of the mice. Mean±SD.△P<0.05,△△P<0.01vsSAM-P/8 group.

圖2小鼠海馬組織勻漿乙酰膽堿酯酶活性的比較

3 中藥Q0409篩選方對(duì)SAM-P/8小鼠海馬CA1區(qū)Aβ蛋白表達(dá)的影響

圖3和表2為小鼠大腦海馬CA1區(qū)Aβ蛋白免疫組化染色照片和海馬CA1區(qū)Aβ蛋白沉積的陽(yáng)性面積的分析結(jié)果。

Figure 3. The photographs of immunohistochemical staining for Aβ in CA1 area of the hippocampus in mice. Left: male; right: female. Scale bar=50 μm.

圖3小鼠大腦海馬CA1區(qū)Aβ蛋白免疫組化染色結(jié)果

表2小鼠海馬CA1區(qū)Aβ蛋白沉積的陽(yáng)性面積
Table 2. The positive area of Aβ deposition in CA1 area of the hippocampus in mice (mm2. Mean±SD)

GroupMaleFemaleControl0△0△△SAM-R/10△△0△△SAM-P/8 1.757±0.0161.942±0.017SAM-P/8+Q04090.013±0.001△△0.052±0.001△△SAM-P/8+HupA0.375±0.005△△0.547±0.006△△

△△P<0.01vsSAM-P/8 group.

雌雄昆明小鼠和SAM-R/1小鼠的海馬CA1區(qū)均未見(jiàn)DAB著色(棕黃色)，僅見(jiàn)蘇木素復(fù)染后的深藍(lán)色細(xì)胞核和藍(lán)色背景，無(wú)Aβ蛋白沉積(陽(yáng)性面積為0 mm2)。SAM-P/8小鼠的海馬CA1區(qū)，箭頭所指區(qū)域可見(jiàn)成片DAB棕黃著色，且范圍較大、顏色較深，為小鼠腦內(nèi)典型病變“老年斑”(較深的棕黃著色為Aβ蛋白沉積較多的部分)，深藍(lán)色的細(xì)胞核為蘇木素復(fù)染所致，藍(lán)色背景不明顯可能與Aβ蛋白廣泛沉積有關(guān)。SAM-P/8+Q0409組雄鼠的海馬CA1區(qū)僅見(jiàn)散在著色很淺的棕黃色，未見(jiàn)典型的“老年斑”，Aβ蛋白沉積的陽(yáng)性面積變小；雌鼠海馬CA1區(qū)箭頭所指區(qū)域仍有“老年斑”，但顏色明顯變淺，Aβ蛋白沉積的陽(yáng)性面積變??；深藍(lán)色細(xì)胞核和藍(lán)色背景為蘇木素復(fù)染所致，提示中藥治療組小鼠海馬Aβ蛋白沉積明顯減少，“老年斑”著色減輕、范圍縮小。SAM-P/8+石杉?jí)A甲組雌雄小鼠海馬CA1區(qū)箭頭所指區(qū)域仍有典型的“老年斑”，雄鼠的斑塊顏色較深但Aβ蛋白沉積的陽(yáng)性面積明顯減小，雌鼠斑塊顏色變淺且Aβ蛋白沉積的陽(yáng)性面積減小，深藍(lán)色細(xì)胞核和藍(lán)色背景為蘇木素復(fù)染所致，提示石杉?jí)A甲治療組小鼠海馬“老年斑”有一定程度的減輕。

討 論

AD按發(fā)病人群可分為家族性AD和散發(fā)性AD，家族性AD按年齡又可分為早發(fā)性AD (<65歲)和晚發(fā)性AD (>65歲)。遺傳學(xué)已發(fā)現(xiàn)3類(lèi)基因，即APP基因、PS-1和PS-2基因及ApoE基因的突變或多態(tài)性與AD的早期發(fā)病有關(guān)。AD有2個(gè)特征性病理變化：由神經(jīng)組織淀粉樣斑塊沉積形成的老年斑和由過(guò)度磷酸化的tau蛋白組成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)。目前，AD的治療僅能控制疾病發(fā)病初期的癥狀，尚缺乏有效藥物阻止疾病進(jìn)展，已有的研究主要采取阻斷老年斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)形成的方法以延緩疾病進(jìn)程，如提高α-分泌酶活性、抑制β-分泌酶和γ-分泌酶的作用、促進(jìn)Aβ的降解和清除、抑制神經(jīng)纖維纏結(jié)等，但臨床效果不佳[1, 7]。傳統(tǒng)的中醫(yī)療法也從病因、發(fā)病機(jī)制及治療等方面對(duì)AD作了深入的研究并顯示了自身優(yōu)勢(shì)，中醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)性治療的成果拓寬了建立多方位靶向治療的思路。本課題組在先前的研究中發(fā)現(xiàn)，中藥Q0409篩選方(人參和遠(yuǎn)志)具有較好的改善小鼠學(xué)習(xí)記憶的能力[3]。其能否在AD的治療中發(fā)揮一定的效果呢？本實(shí)驗(yàn)擬選用AD疾病模型小鼠SAM-P/8快速老化系小鼠為模型，運(yùn)用中藥Q0409篩選方進(jìn)行干預(yù)，以觀察該方對(duì)AD疾病模型的作用及可能機(jī)制。同時(shí)選用石杉?jí)A甲作為陽(yáng)性對(duì)照藥物。

快速老化小鼠(senescence-accelerated mouse，SAM)具備均一的遺傳背景和穩(wěn)定老化病態(tài)特征[8]。SAM品系中，P8 除具有P品系的一般老化癥狀外，伴快速老化而自然出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶力障礙和低恐怖、低緊張狀態(tài)，為腦老化癡呆模型小鼠。其特點(diǎn)是具有認(rèn)知障礙，且在渡過(guò)生長(zhǎng)期后(4～6月)，伴快速老化自然發(fā)生，與臨床癡呆的漸進(jìn)性發(fā)生極為相似，與人類(lèi)衰老和癡呆的臨床特征非常接近，不同于造模動(dòng)物和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物只具有單一的衰老特征，行為學(xué)、形態(tài)學(xué)、神經(jīng)生化和分子生物學(xué)的研究為此提供了較充足的證據(jù)。目前，美、中、日、韓等國(guó)學(xué)者采用此模型進(jìn)行了大量相關(guān)的基礎(chǔ)研究和藥物研究，SAM-P/8系小鼠為我們進(jìn)一步深入理解老化和癡呆的機(jī)制提供了一種理想的自然發(fā)病模型[9]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇AD的自然發(fā)病模型小鼠——快速老化系小鼠SAM-P/8作為研究對(duì)象，以觀察中藥Q0409篩選方對(duì)該AD自然發(fā)病模型的影響。因?yàn)镾AM-P/8系小鼠衰老發(fā)病的關(guān)鍵時(shí)期為4～6月齡，是其機(jī)體各方面生理、病理指標(biāo)變化最快、最明顯的時(shí)期。有研究證實(shí)了4月齡與6月齡SAM-P/8小鼠，各方面指標(biāo)差異明顯，而6月齡、8月齡和12月齡SAM-P/8小鼠則在各方面指標(biāo)差異不明顯[10]。所以，本實(shí)驗(yàn)把藥物(中藥Q0409篩選方或石杉?jí)A甲)的干預(yù)時(shí)間選定為4月齡小鼠，連續(xù)給藥2個(gè)月。

本研究選用的陽(yáng)性對(duì)照藥物石杉?jí)A甲是我國(guó)科學(xué)家于1986 年從民間草藥千層塔(蛇足石杉，Huperziaserrata)中分離得到的一種新型石松類(lèi)生物堿有效單體[11]，具有極高的選擇性抑制腦內(nèi)乙酰膽堿酯酶和增強(qiáng)腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)元的功能，此外，還具有作用時(shí)間長(zhǎng)、易透過(guò)血腦屏障、口服生物利用度高以及不良反應(yīng)少等多種優(yōu)點(diǎn)，效果優(yōu)于加蘭他敏、多奈哌齊和他克林等臨床藥物[12-13]。

本研究分別從小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力(行為學(xué))、神經(jīng)生化指標(biāo)(海馬組織AChE活性)和組織形態(tài)學(xué)(Aβ蛋白免疫組化)3個(gè)方面對(duì)中藥Q0409篩選方干預(yù)AD模型小鼠的作用及其初步機(jī)制進(jìn)行了探討。

中藥Q0409篩選方治療組小鼠的行為學(xué)測(cè)試(Morris水迷宮)結(jié)果顯示，治療組比疾病模型組(SAM-P/8)小鼠在學(xué)習(xí)訓(xùn)練第1～4天的逃避潛伏期明顯縮短，第5天的記憶成績(jī)(目標(biāo)象限停留時(shí)間和游泳經(jīng)過(guò)平臺(tái)次數(shù))較疾病模型組小鼠有明顯提高，與2個(gè)正常對(duì)照組和石杉?jí)A甲治療組的小鼠比較，學(xué)習(xí)和記憶成績(jī)的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。提示中藥Q0409篩選方可以改善AD自然發(fā)病模型SAM-P/8小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力，與石杉?jí)A甲效果相似。

中藥Q0409篩選方治療組小鼠的神經(jīng)生化指標(biāo)(海馬組織AChE活性)的結(jié)果表明，石杉?jí)A甲治療組(陽(yáng)性藥物對(duì)照組)小鼠海馬組織AChE活性最低，其次是中藥治療組，而活性最高的是疾病模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。這一結(jié)果提示,中藥Q0409篩選方改善SAM-P/8小鼠學(xué)習(xí)記憶的能力可能與其具有抑制小鼠海馬區(qū)的AChE活性有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)采用Aβ蛋白特異性抗體的免疫組化染色(DAB顯色)，由免疫組化染色的結(jié)果可以看到，疾病模型小鼠(SAM-P/8系小鼠)海馬區(qū)的Aβ蛋白沉積較為廣泛，部分形成了明顯的“老年斑”，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[14]；而正常昆明小鼠和SAM-R/1系對(duì)照小鼠的Aβ蛋白免疫組化染色均為陰性，僅見(jiàn)蘇木素復(fù)染所致深藍(lán)色的細(xì)胞核和藍(lán)色背景，與SAM-P/8系小鼠差異十分明顯；而中藥Q0409篩選方治療組雄鼠未見(jiàn)典型的“老年斑”，雌鼠可見(jiàn)“老年斑”顏色變淺，二者的海馬CA1區(qū)Aβ蛋白沉積的陽(yáng)性面積減少，這一結(jié)果與人類(lèi)的老年性癡呆病存在性別差異的特點(diǎn)亦有相似之處。根據(jù)Aβ蛋白沉積的陽(yáng)性面積的結(jié)果還可以看出，中藥治療組的Aβ蛋白沉積輕于石杉?jí)A甲治療組。這一結(jié)果提示，中藥Q0409篩選方改善AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用與其減少AD模型小鼠海馬區(qū)的Aβ蛋白沉積有關(guān)。

綜上所述，中藥Q0409篩選方可以明顯提高AD模型小鼠(SAM-P/8小鼠)的學(xué)習(xí)和記憶能力，其初步機(jī)制可能與其抑制小鼠海馬區(qū)AChE活性，減少Aβ蛋白沉積，進(jìn)而減輕由Aβ所致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡等有關(guān)；其療效與石杉?jí)A甲相似。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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