曾嘉豪，楊承佑，文 軍，張茂營，王向宇

(暨南大學(xué), 暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科， 廣東 廣州 510632)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一類進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)退行性疾病。全球80%以上的老年癡呆患者被確診為AD[1]，目前約有5億，并且，這一數(shù)字還在逐年上升。統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，平均每33秒就有1例AD患者出現(xiàn)，每年新增1億，而到2050年預(yù)計該類病人的總?cè)藬?shù)將達(dá)到13.8億[2]。AD病人存在認(rèn)知障礙且生活不能自理[3]。隨著全球人口老齡化，AD 患者所占比例增加，將給社會帶來了極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，研究和探討如何控制和治療 AD 具有極其重要的臨床意義。AD的發(fā)病機(jī)制目前尚未明確，由β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein, Aβ)在細(xì)胞外形成的老年斑(senile plaque, SP)和tau蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillar tangles, NFTs)是AD的2大病理特征[4]。至今AD的治療仍缺乏明確的治療手段和治療效果。

芍藥苷(paeoniflorin, PF)屬于單帖糖苷類化合物，是毛茛科植物芍藥干燥根中的主要生物活性成份，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化和清除氧自由基等作用[5]，并能抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善學(xué)習(xí)記憶障礙等作用[6-7]。PF在帕金森病(Parkinson’s disease，PD)和AD等神經(jīng)退行性疾病的治療中也表現(xiàn)出了良好的療效[8]。前期研究結(jié)果顯示PF在治療APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因老年癡呆模型小鼠顯示出了良好的抗炎、減少Aβ的沉積和改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙作用，但是PF是否通過抑制細(xì)胞凋亡通路來抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡和保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞仍未有明確的研究表明[9]。因此，本實驗驗證PF是否通過抑制細(xì)胞凋亡信號通路來抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙作為研究方向，并進(jìn)一步探究PF抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的機(jī)制，從而找到一條合理治療AD病人的新途徑，旨在為PF治療AD的臨床應(yīng)用及產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程提供重要的理論支持和實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

SPF級APP/PS1(PAP)雙轉(zhuǎn)基因陽性小鼠(基因型：T)30只，雄性，5月齡，體重范圍30～40 g,購自南京大學(xué)動物模式中心，合格證號為SCXK(蘇)2015-0001； SPF級APP/PS1(PAP)雙轉(zhuǎn)基因陰性小鼠(基因型：W)15只，雄性，5月齡，體重范圍為30～40 g, 購自南京大學(xué)動物模式中心，合格證號為SCXK(蘇)2015-0001。

2 主要設(shè)備及試劑

DYY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠);DMIL型倒置顯微鏡和冰凍切片機(jī)(Leica)。芍藥苷(上海源葉生物科技有限公司； HPLC 98%)；TUNEL試劑盒(Roche)；anti-PI3K、anti-p-PI3K、anti-Akt、anti-p-Akt、anti-caspase-3、anti-caspase-9、anti-Bcl-2和anti-Bax等單克隆抗體購自于Abcam；抗β-actin多克隆抗體(Santa Cruz);HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(EarthOx)。

3 實驗分組、處理及指標(biāo)檢測

3.1實驗分組及處理 取APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因(基因型：T)小鼠30只，雄性，體重范圍30～40 g，隨機(jī)分為2組，分別為AD模型(AD)組和PF給藥(PF，5 mg/kg)組，每組15只動物，同時設(shè)置普通APP/PS1(PAP)非顯性(基因型：W)小鼠作為正常對照(WT)組。參照前期實驗給予PF給藥組腹腔注射給藥，AD模型組和正常對照組予等量生理鹽水腹腔注射，每天1次，連續(xù)8周。

3.2Morris水迷宮測試 給腹腔注射給藥結(jié)束后，將每組每只小鼠由平臺象限的頭朝池壁放入水迷宮池中，進(jìn)行老鼠定位航行的實驗。小鼠實驗水迷宮共6 d(訓(xùn)練階段+正式實驗階段)，記錄小鼠找到水迷宮平臺所需的時間，為小鼠逃避潛伏期的時間。第7天撤除平臺，后將每只小鼠從原平臺所在象限的頭朝池壁放入水池中，記錄1 min中內(nèi)小鼠的游泳軌跡以及穿越平臺的次數(shù)，然后所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理分析。

3.3樣品處理 水迷宮實驗結(jié)束后，麻醉小鼠，將每組中的7只小鼠腦組織于冰盒中放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，另?只小鼠灌流4% 多聚甲醛(paraformaldehyde,PFA)，取出腦組織放入4% PFA中過夜，之后進(jìn)行下一步實驗。

3.4TUNEL法檢測PF對神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響 每組分別取4只小鼠灌流4% PFA，取出腦組織于梯度乙醇脫水、二甲苯透明后進(jìn)行石蠟包埋，進(jìn)行2.5 μm厚度切片，脫蠟后按照TUNEL試劑盒說明書進(jìn)行染色，熒光顯微鏡拍照，每只小鼠取5張熒光圖，通過ImageJ軟件統(tǒng)計細(xì)胞凋亡個數(shù)。

3.5免疫組化染色法檢測凋亡相關(guān)蛋白在小鼠大腦的表達(dá) 每組分別取4只小鼠灌流4% PFA，取出腦組織，進(jìn)行石蠟包埋，切片，將石蠟切片按前期實驗步驟進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，檢測凋亡相關(guān)蛋白caspase-3和caspase-9的表達(dá)水平和分布情況，白光顯微鏡拍照，每只鼠取10張免疫組織化學(xué)圖片，通過ImageJ軟件處理相關(guān)凋亡蛋白的定位情況。

3.6Western Blot法檢測凋亡相關(guān)因子的表達(dá)及其磷酸化表達(dá)水平 從-80 ℃中取出大腦，放入冰盒上，分離出海馬區(qū)域及皮層并稱重，用 BCA 方法測定樣品蛋白濃度，每孔上樣量為 20 μg。 使用4%～20%的 Tris-glycine 分離蛋白。先以 80 V電壓電泳 45 min，再將電壓調(diào)至120 V繼續(xù)電泳1 h左右。 從負(fù)極到正極依次按海綿、濾紙、凝膠、PVDF 膜、濾紙、海綿的順序，在 4 ℃ 轉(zhuǎn)移緩沖液中于300 mA電流條件下轉(zhuǎn)膜90 min。將膜置于5% 脫脂牛奶中，室溫下封閉60 min。 加入Ⅰ抗，4 ℃孵育過夜。 用 0.1% PBST 洗膜3次，每次10 min。加入Ⅱ抗，室溫下孵育1 h，然后用 0.05% PBST 漂洗 3 次，每次 10 min。之后滴加顯影液進(jìn)行顯影。使用Quantity One軟件對結(jié)果進(jìn)行處理分析。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示。 所有的數(shù)據(jù)使用 GraphPad Prism 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。多組間比較采用單因素方差分析，經(jīng)方差齊性檢驗后，方差齊同采用Bonferroni 及 LSD法進(jìn)行組間兩兩比較，方差不齊用Tamhane’s T2檢驗進(jìn)行組間兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PF提高APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力

給藥8周后，水迷宮實驗結(jié)果顯示，經(jīng)過5 d的水迷宮訓(xùn)練，在第6天實驗結(jié)果中AD組小鼠比WT小鼠逃離潛伏期明顯延長，兩者相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義；而與AD組小鼠比較，PF組小鼠的逃離潛伏期明顯縮短(P<0.05)，見圖1A。如圖1B顯示，AD組小鼠與WT組小鼠比較，穿越平臺次數(shù)較少，兩者比較有顯著差異；與AD組小鼠比較，PF給藥組小鼠的穿越平臺次數(shù)明顯增加(P<0.05)。這些結(jié)果說明PF能夠提高APP/PS1小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。

Figure 1. PF improved the learning and memory ability ofAPP/PS1 mice. Mean±SEM.n=7.*P<0.05vsWT group;#P<0.05,##P<0.01vsAD group.

圖1PF可以改善APP/PS1小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力

2 PF對AD小鼠腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

連續(xù)給藥8周后，經(jīng)TUNEL法染色后的大腦，可觀測WT組腦切片未見海馬區(qū)域及皮層有明顯綠色熒光的凋亡細(xì)胞分布；APP/PS1模型組海馬區(qū)域及皮層區(qū)均可見大量的綠色熒光細(xì)胞且分布廣泛，與正常對照組比較有顯著差異(P<0.05)；而PF給藥組綠色熒光細(xì)胞明顯減少，與APP/PS1模型組比較有顯著差異(P<0.05)，說明PF能夠明顯減輕APP/PS1小鼠腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，見圖2。

3 PF對AD小鼠腦內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt表達(dá)的影響

連續(xù)給藥8周后，經(jīng)Western blot檢測，可發(fā)現(xiàn)各組PI3K及Akt表達(dá)沒有明顯的改變，APP/PS1模型組p-PI3K及p-Akt均有下降趨勢，與WT對照組相比具有明顯差異(P<0.05)；PF給藥組p-PI3K及p-Akt表達(dá)明顯上升，與AD模型組相比有顯著差異(P<0.05)，提示PF的干預(yù)能夠在一定程度上促進(jìn)AD小鼠腦內(nèi)PI3K及Akt的磷酸化，見圖3。

4 PF對AD小鼠腦內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3及caspase-9表達(dá)的影響

如圖4所示，連續(xù)給藥8周后，WT對照組小鼠腦組織切片在海馬及顳葉皮層僅有少數(shù)區(qū)域表達(dá)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3和caspase-9；APP/PS1模型組caspase-3和caspase-9表達(dá)水平較高，且分布廣泛；PF給藥組腦組織內(nèi)的caspase-3和caspase-9的蛋白表達(dá)量下降，且分布區(qū)域較小。

Figure 2. PF inhibited the apoptosis of nerve cells inAPP/PS1 mice. Mean±SEM.n=4.*P<0.05vsWT group;#P<0.05vsAD group.

圖2PF可以抑制APP/PS1小鼠腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞凋亡

Figure 3. The protein expression of Akt, p-Akt, PI3K and p-PI3K in the hippocampus and cortex of the mice in each group. Mean±SEM.n=4.*P<0.05vsWT group;#P<0.05vsAD group.

圖3各組標(biāo)本海馬及皮層區(qū)Akt、p-Akt、PI3K和p-PI3K蛋白的Westernblot檢測結(jié)果

Figure 4. Expression of caspase-9 and caspase-3 in hippocampus of the mice in each group.

圖4各組海馬中caspase-9和caspase-3的表達(dá)結(jié)果

如圖5所示，連續(xù)給藥8周后，經(jīng)Western blot法檢測，APP/PS1模型組caspase-3和caspase-9的蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，與WT對照組比較，具有顯著差異(P<0.05)，PF給藥組小鼠腦內(nèi)caspase-3、caspase-9的蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，與APP/PS1模型組比較有顯著差異(P<0.05)，與免疫組化檢測結(jié)果相吻合，提示PF能夠明顯抑制AD小鼠腦內(nèi)海馬區(qū)域及皮層凋亡相關(guān)蛋白caspase-3及caspase-9的表達(dá)。

Figure 5. Expression of caspase-3 and caspase-9 in hippocampus and cortex. Mean±SEM.n=4.*P<0.05vsWT group;#P<0.05vsAD group.

圖5海馬和皮質(zhì)中caspase-3及caspase-9表達(dá)水平檢測結(jié)果

5 PF對AD小鼠腦內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2及Bax表達(dá)水平的影響

如圖6所示，連續(xù)給藥8周后，經(jīng)Western blot法檢測，APP/PS1模型組Bax表達(dá)明顯上調(diào)，Bcl-2表達(dá)水平明顯下調(diào)，與WT對照組比較有顯著差異(P<0.05)；PF給藥組Bax表達(dá)明顯下調(diào)，Bcl-2表達(dá)水平明顯上調(diào)，與APP/PS1模型組比較有顯著差異(P<0.05)，與免疫組化檢測結(jié)果相吻合。這些結(jié)果提示PF能夠在明顯抑制AD小鼠腦內(nèi)海馬區(qū)域及皮層凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)，上調(diào)Bcl-2的表達(dá)；PF可能通過抑制凋亡通路來改善APP/PS1小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。

Figure 6. Expression of Bax and Bcl-2 protein in hippocampus and cortex. Mean±SEM.n=4.*P<0.05vsWT group;#P<0.05vsAD group.

圖6海馬和皮質(zhì)中Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)水平檢測結(jié)果

討 論

AD病人的臨床表現(xiàn)主要為認(rèn)知功能障礙。學(xué)習(xí)和記憶是認(rèn)知的基礎(chǔ)，目前主要通過 Morris 水迷宮等實驗等來評價動物的學(xué)習(xí)記憶能力[10-12]。20 世紀(jì) 80 年代初，英國著名心理學(xué)家Morris 設(shè)計發(fā)明了用于檢測學(xué)習(xí)記憶的 Morris 水迷宮[13]。根據(jù)動物逃離潛伏期時間的長短和穿過平臺所在位置的次數(shù)來判斷小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。所以本實驗采用水迷宮檢測小鼠學(xué)習(xí)記憶能力?，F(xiàn)在，APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠過表達(dá)人的突變APP和PS1基因，可較早地引起Aβ沉積和早老素生成相關(guān)的病理損傷、突出障礙和認(rèn)知功能障礙[14]，為國際上較為公認(rèn)的AD動物模型小鼠。神經(jīng)細(xì)胞凋亡是AD腦內(nèi)最為直觀的病理表現(xiàn)，AD患者腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率比正常人高出30～50倍。在體外實驗中，Zhang等[15]人在小鼠皮質(zhì)及海馬培養(yǎng)細(xì)胞中加入了Aβ，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞中出現(xiàn)凋亡小體，并在生化水平呈現(xiàn)出了典型的細(xì)胞凋亡特征。

本研究通過水迷宮實驗驗證PF能夠改善APP/PS1小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力，然后通過TUNEL凋亡細(xì)胞檢測發(fā)現(xiàn)了PF能夠顯著減少腦內(nèi)海馬區(qū)域及皮層細(xì)胞的凋亡，本研究的實驗數(shù)據(jù)首先證實了PF組小鼠的逃離潛伏期變長，穿越平臺次數(shù)變多，說明PF能夠改善APP/PS1小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。隨后通過TUNEL實驗驗證了PF能夠減少APP/PS1小鼠腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

為進(jìn)一步探究PF抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間的相關(guān)性機(jī)制研究，本實驗通過對凋亡相關(guān)蛋白PI3K/Akt、Bcl-2/Bax、caspase-3及caspase-9進(jìn)行檢測。前期研究表明，被激活的PI3K能夠活化Akt，后者能夠進(jìn)一步激活下游的關(guān)鍵凋亡相關(guān)蛋白[16]?；罨腁kt能夠直接誘導(dǎo)抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2上調(diào)、抑凋亡相關(guān)蛋白Bax和caspase-9下調(diào)，而caspase-9的下調(diào)同時亦能夠抑制其下游蛋白caspase-3的表達(dá)[17]。Caspase家族內(nèi)的成員包括細(xì)胞凋亡的啟動子、效應(yīng)子、炎癥相關(guān)因子，caspase-9屬于第一類，其位于級聯(lián)反應(yīng)上游，受到影響活化后可以激活下游的caspase；caspase-3屬于第二類，是家族中最為重要的蛋白，位于下游，是參與凋亡執(zhí)行的極為重要的效應(yīng)子，一旦被激活便可引起下游級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。而Bcl-2家族亦是重要的細(xì)胞凋亡調(diào)控蛋白，Bcl-2是一種強(qiáng)力的細(xì)胞凋亡抑制劑，其能夠通過多種途徑抑制細(xì)胞凋亡的級聯(lián)反應(yīng)；與之相反，Bax的過度表達(dá)會加速細(xì)胞凋亡。研究表明，Bcl-2/Bax的比值在中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元凋亡中起關(guān)鍵作用。本次實驗通過WB檢測證明了PF能夠上調(diào)p-PI3K和p-Akt的表達(dá)水平從而活化PI3K/Akt通路，提示PF能夠激活PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而啟動下游的抗凋亡級聯(lián)反應(yīng)，上調(diào)Bcl-2的表達(dá)水平,抑制Bax、caspase-3和caspase-9蛋白的表達(dá)水平，從而達(dá)到干擾細(xì)胞凋亡通路的級聯(lián)反應(yīng)，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用，來改善APP/PS1小鼠的學(xué)習(xí)記憶。

我們通過TUNEL凋亡細(xì)胞檢測證實了PF治療能夠顯著減少AD模型中的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，PF抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用可能是激活PI3K/Akt通路、繼而上調(diào)Bcl-2的表達(dá)水平、抑制caspase-9、caspase-3和Bax的表達(dá)從而抑制細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路， PF的長期治療甚至可以改善神經(jīng)退行性疾病的癥狀，從而達(dá)到疾病的延緩發(fā)生。盡管PF對導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響仍需要作進(jìn)一步的大量研究，但結(jié)合前期實驗成果，目前我們的實驗數(shù)據(jù)仍可表明PF的使用是AD治療其中一種有效手段。

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