張彩鳳，韓 宇，夏永華，杜學芳，肖懷蔥，趙潤根，張利利，楊雙梅

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 1消化內科， 2皮膚科， 3麻醉科， 河南 衛(wèi)輝 453100)

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一[1]。盡管在早期診斷和治療中具有明顯的進展，但胃癌患者仍占全球所有腫瘤相關死亡的9%[2-3]。因而尋找新的分子靶點對于胃癌患者的治療具有十分重要的價值。X染色體連鎖的泛素特異性肽酶 9(ubiquitin-specific peptidase 9, X-linked，USP9X)作為一種去泛素化酶(deubiquitylating enzyme，DUB)能調控多種不同的信號途徑[4-5]。USP9X也被證實參與很多疾病特別是腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[6-10]。USP9X在不同的腫瘤中可能發(fā)揮不同的作用，在胰腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)USP9X的缺失能加速胰腺癌的產生，表明其在胰腺癌中主要是腫瘤抑制基因；但在多發(fā)性骨髓瘤中，USP9X的過表達與患者的不良預后密切相關，提示其可能是癌基因。最近來自胃癌的一項研究表明，USP9X在胃癌組織中呈現(xiàn)高表達，其表達與淋巴結轉移、遠端轉移和腫瘤分期密切相關，USP9X的高表達能降低胃癌患者總的生存率，是胃癌患者獨立的預后因子[11]，因而在胃癌中USP9X可能發(fā)揮癌基因的作用。但其在胃癌中確切的功能尚不清楚。因此，在本研究中，我們利用RNA干擾技術下調胃癌細胞中USP9X的表達，分析其表達下調對胃癌細胞凋亡和侵襲的影響，并初步探討其可能的分子機制。該研究有望為以USP9X為靶點的胃癌基因治療奠定基礎。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

人胃癌AGS細胞購自中科院上海細胞庫。脂質體2000轉染試劑購自Invitrogen；USP9X小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)、對照siRNA以及鼠抗人USP9X、髓樣細胞白血病蛋白1(myeloid cell leukemia 1，Mcl-1)、Bax、基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)和β-actin單克隆抗體均購自Santa Cruz；RPMI-1640 購自Life Technologies；胎牛血清購自HyClone；凋亡檢測試劑盒Annexin V-FITC購自eBiosciences；基質膠購自BD。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng) 胃癌AGS細胞用RPMI-1640培養(yǎng)基，并補充10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素，于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗所用的AGS細胞處于對數(shù)生長期。

2.2siRNA轉染及分組 當AGS細胞融合度達90%左右時，將USP9X siRNA和對照siRNA按照脂質體2000說明書進行轉染，并于轉染后48 h進行相關的實驗。實驗分為3組：AGS組(未處理的AGS細胞)、siRNA control組(用對照siRNA轉染AGS細胞)和USP9XsiRNA組(用USP9XsiRNA轉染AGS細胞)。

2.3Real-time PCR 從各個不同轉染的胃癌AGS細胞中提取總RNA，并反轉錄成cDNA，以cDNA為模板，利用實時熒光定量PCR特定的試劑盒(北京天根生化科技有限公司)將各個不同的組份加入至反應體系中，擴增USP9X的上游引物序列為5’-CATGGACCTGGCTCTCAGTG-3’， 下游引物序列為5’-AAACACATGGGGACTTCGCT-3’，產物大小為220 bp；擴增內參照β-actin的上游引物序列為5’-AACTGGGACGACATGGAGAAAA-3’， 下游引物序列為5’-GGATAGCACAGCCTGGATAGCA-3’，產物大小為192 bp。USP9X的mRNA相對表達水平采用2-ΔΔCt法進行計算。

2.4Western blot實驗 從各個不同轉染的胃癌AGS細胞中提取總蛋白，采用SDS-PAGE對蛋白進行分離，然后將其轉膜，封閉后加入針對USP9X、Mcl-1、Bax、MMP-2和β-actin的 I 抗，然后加入 II 抗，最后采用ECL發(fā)光液進行曝光顯示出特定的蛋白條帶，蛋白的相對表達水平=目的蛋白的灰度值/β-actin的灰度值。

2.5CCK-8法檢測細胞活力 將不同處理的胃癌AGS細胞接種至96孔板中，每孔為2 000個細胞。按照CCK-8試劑盒(中國碧云天生物工程有限公司)的說明書，檢測不同時點AGS細胞的活力。最后利用GraphPad Prism 6.0軟件繪制細胞的生長曲線。

2.6流式細胞術檢測細胞凋亡USP9XsiRNA和對照siRNA轉染胃癌AGS細胞后于48 h收獲細胞，采用預冷PBS緩沖液漂洗，按1×109/L的密度重懸細胞，接著取100 μL細胞置于流式管中，加入Annexin V-FITC和碘化丙啶各5 μL，于避光下孵育15 min后采用流式細胞術檢測10 000個細胞，最后采用CellQuest軟件分析細胞凋亡的結果。

2.7Boyden小室檢測細胞的侵襲能力 將各個不同處理的胃癌AGS細胞(每組1×105個)分別懸浮在含有0.2%小牛血清的800 μL培養(yǎng)基中，然后將各個不同處理的胃癌AGS依次接種至Boyden小室的上層，培養(yǎng)6 h。然后收集濾膜下層的細胞，并采用甲醇進行固定，并通過HE染色來觀察下層細胞的數(shù)量，最后通過計算濾膜下層的細胞數(shù)來評估其穿膜的細胞數(shù)(30個視野，×200)。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學處理。所有的實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，3組之間差異的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 USP9X siRNA下調胃癌AGS細胞中USP9X的mRNA表達

Real-time PCR結果表明，USP9XsiRNA組中USP9X的mRNA相對表達水平顯著低于未處理的AGS組和對照siRNA組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);然而，未處理的AGS組和對照siRNA組之間USP9X的mRNA相對表達水平的差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖1。

Figure 1. The mRNA expressions of USP9X in the AGS cells with different treatments detected by real-time PCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsAGS group and siRNA control group.

圖1Real-timePCR檢測各個不同處理的AGS細胞中USP9XmRNA的表達

2 USP9X siRNA下調胃癌AGS細胞中USP9X蛋白的表達

Western blot實驗結果顯示，USP9XsiRNA組中USP9X蛋白的表達水平顯著低于未處理的AGS組和對照siRNA組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；然而，未處理的AGS組和對照siRNA組之間USP9X蛋白表達水平的差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖2。

Figure 2. The protein expression of USP9X in the AGS cells with different treatments. Mean±SD.n=4.*P<0.05vsAGS group and siRNA control group.

圖2USP9X蛋白在各個不同處理的AGS細胞中的表達

3 USP9X表達下調顯著抑制胃癌AGS細胞的活力

CCK-8實驗分析不同處理組別AGS細胞的活力，結果見圖3。與未處理組和對照siRNA組相比，USP9XsiRNA轉染的AGS細胞的活力顯著受到抑制，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；然而，未處理組的AGS細胞和對照siRNA轉染的AGS細胞之間相比，其細胞活力的差異無統(tǒng)計學顯著性。

Figure 3. The effect of USP9X down-regulation on the viability of gastric carcinoma AGS cells. Mean±SD.n=4.*P<0.05vsAGS group and siRNA control group.

圖3USP9X表達下調對胃癌AGS細胞活力的影響

4 下調USP9X表達對胃癌AGS細胞凋亡的影響

流式細胞術結果表明，USP9XsiRNA組中胃癌細胞的早期凋亡率顯著高于未處理的AGS組和對照siRNA組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);此外，USP9XsiRNA組中胃癌AGS細胞的活細胞比率顯著低于未處理的AGS組和對照siRNA組(P<0.01),見圖4。

5 下調USP9X表達對胃癌AGS細胞侵襲能力的影響

Boyden小室實驗結果表明，USP9XsiRNA組中胃癌AGS細胞的穿膜數(shù)顯著低于未處理的AGS組和對照siRNA組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);然而，未處理的AGS組和對照siRNA轉染的AGS組相比，胃癌AGS細胞穿膜數(shù)的差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖5。

6 下調USP9X表達對凋亡和侵襲相關蛋白表達的影響

為了進一步探討USP9X在胃癌細胞凋亡和侵襲調控中的可能分子機制，我們采用Western blot檢測不同處理組別胃癌AGS細胞中Mcl-1、Bax和MMP-2蛋白的表達。結果表明，與未處理的AGS組和對照siRNA轉染的AGS組相比，USP9X siRNA組中Mcl-1和MMP-2表達顯著下調，而Bax蛋白表達顯著上調(P<0.05或P<0.01)，提示USP9X表達下調介導的凋亡和侵襲能力變化可能與Mcl-1、Bax和MMP-2表達變化密切相關,見圖6。

Figure 4. The effects of down-regulation of USP9X expression on apoptosis of gastric carcinoma AGS cells. Mean±SD.n=4.**P<0.01vsAGS group and siRNA control group.

圖4USP9X表達下調對胃癌AGS細胞凋亡的影響

Figure 5. Down-regulation of USP9X expression inhibited invasion ability of gastric carcinoma AGS cells (HE staining,×200). Mean±SD.n=4.**P<0.01vsAGS group and siRNA control group.

圖5USP9X表達下調抑制胃癌AGS細胞的侵襲能力

Figure 6. The protein expression of Mcl-1, Bax and MPP-2 in the AGS cells with different treatments determined by Western blot. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsAGS group and siRNA control group.

圖6Westernblot檢測各個不同處理的AGS細胞中Mcl-1、Bax和MMP-2蛋白的表達

討 論

研究表明，泛素化在蛋白質降解和蛋白質功能調控中發(fā)揮重要作用[12]，這個過程受泛素連接酶和去泛素化酶的精確調控[13]。USP9X作為去泛素酶家族的成員之一，能使底物去泛素化，并使其在細胞內穩(wěn)定存在，從而調控多種不同的細胞功能。研究表明，高表達的USP9X通過調控特定的基因從而牽涉到腫瘤的生長、侵襲和轉移，如Mcl-1、β-catenin和轉化生長因子-β等。最近研究進一步顯示在人腫瘤組織中USP9X的表達與Mcl-1(Bcl-2家族的成員之一)相關[7]，提示USP9X可能參與腫瘤細胞的凋亡調控，因而可能成為腫瘤分子靶向治療潛在的分子靶點。

由于去泛素化酶包括USP9X在許多人類腫瘤中發(fā)揮重要作用[14]，因此有必要開發(fā)特異性的去泛素化酶抑制劑作用于腫瘤潛在的治療靶點。在本研究中，我們首先采用RNA干擾技術，將USP9XsiRNA轉染胃癌AGS細胞，發(fā)現(xiàn)其在48 h能顯著抑制胃癌AGS細胞中USP9X mRNA和蛋白的表達，這一結果為進一步探討USP9X在胃癌中的功能奠定基礎。

研究表明，USP9X牽涉到許多重要的細胞生物學過程的調控，如細胞黏附、侵襲、轉移以及細胞凋亡等。Dupont等[15]發(fā)現(xiàn)USP9X能調控細胞的黏附過程，這主要通過β-catenin和E-cadherin表達的變化發(fā)揮作用。此外，USP9X能調控mTOR和TGFβ信號途徑，這些信號途徑廣泛參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。USP9X也能通過調控p53和抗凋亡蛋白Mcl-1從而調控腫瘤細胞的凋亡過程[7]。這些研究從分子水平解析USP9X在調控腫瘤細胞侵襲和凋亡中所涉及的關鍵分子事件。此外，F(xiàn)u等[11]研究小組研究胃癌組織中USP9X的表達時發(fā)現(xiàn)USP9X的表達與Mcl-1呈正相關，并且與淋巴結轉移、遠端轉移、腫瘤分期密切相關，提示USP9X可能在胃癌細胞凋亡、侵襲和轉移中發(fā)揮重要作用，但確切的生物學功能尚不清楚。因此，在目前的研究中，我們采用流式細胞術和Boyden小室檢測下調USP9X表達對胃癌AGS細胞凋亡和侵襲的影響，結果表明下調USP9X表達能明顯誘導胃癌細胞凋亡，并顯著降低胃癌細胞的侵襲能力，這些結果提示USP9X可能在胃癌細胞的凋亡和侵襲過程中發(fā)揮重要的作用。此外，在此基礎上，我們進一步分析不同處理的胃癌AGS細胞中凋亡相關蛋白Mcl-1和Bax以及侵襲相關蛋白MMP-2的表達，發(fā)現(xiàn)下調USP9X表達能明顯降低Mcl-1和MMP-2的表達，但顯著增加Bax蛋白的表達，這可能是下調USP9X表達引發(fā)胃癌細胞凋亡和侵襲改變的原因之一，但確切的分子機制仍需要進一步闡明。

總之，本研究采用的USP9XsiRNA能顯著下調胃癌細胞中USP9X mRNA和蛋白的表達水平，其表達水平的下調誘導胃癌細胞凋亡和降低其侵襲能力，并明顯降低Mcl-1和MMP-2的表達，但顯著增加Bax蛋白的表達。這些研究表明未來進一步闡明其詳細的分子調控機制有望為以USP9X為靶點的胃癌的分子靶向治療提供理論依據(jù)。

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