劉特思，閆文帝▲，王 雪，呂 游，樸英實, 2，林貞花, 2，任香善, 2△

(延邊大學 1腫瘤研究中心， 2醫(yī)學院病理學教研室， 吉林 延邊 133002)

膽管癌是一種來源于膽管上皮細胞的惡性腫瘤，流行病學統(tǒng)計顯示，膽管癌的發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢。目前對膽管癌的治療以外科手術(shù)為主，放化療為輔[1]。

研究表明，磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(portein kinase B, PKB/Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路的激活與膽管癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2-3]。AZD8055是一種新型mTOR雙重抑制劑，可同時抑制mTORC1和mTORC2復合物，且具有ATP競爭性[4]。李鵬等[5]研究發(fā)現(xiàn)AZD8055在體外通過促進肝癌Huh7細胞凋亡來抑制細胞的增殖；Li等[6]研究發(fā)現(xiàn)AZD8055通過抑制mTORC1和mTORC2，并同時激活JNK信號通路，誘導肝癌細胞的自噬，從而起到抑制肝癌細胞增殖的作用。以上研究提示AZD8055具有抗腫瘤的作用。目前，AZD8055對多種腫瘤包括婦科腫瘤、肺癌和白血病等[7-9]具有抗腫瘤作用，但尚未見AZD8055在膽管癌中的相關(guān)研究。既然PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活與膽管癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而AZD8055又是mTOR的抑制劑，我們推測AZD8055對膽管癌細胞可能有抑制作用。本研究旨在探究mTOR抑制劑AZD8055在膽管癌細胞中的抗腫瘤作用，闡明其相關(guān)機制，為AZD8055在臨床抗膽管癌治療提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1細胞系 人膽管癌HuCCT1細胞由日本金澤大學病理學教研室提供。

1.2試劑與抗體 AZD8055購自Selleck Chemicals，用DMSO配制濃縮液，分裝保存于-20 ℃冰箱；抗Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、LC3、beclin 1和p62抗體均購自Cell Signaling Technology；抗β-actin抗體購自Abcam；RPMI-1640培養(yǎng)基購自Corning；胎牛血清購自Gibco；Annexin V-FITC/PI檢測試劑盒購自于BD。

2 主要方法

2.1細胞培養(yǎng) 細胞培養(yǎng)用RPMI-1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素)，于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

2.2MTT實驗 取對數(shù)生長期的HuCCT1細胞，以每孔5 000個接種于96孔板，實驗設(shè)置對照(control)組及50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L和400 nmol/L AZD8055用藥組，每組設(shè)置6個平行孔。在37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h、72 h和120 h后進行MTT檢測，用全波長分光光度儀在490 nm處檢測吸光度。

2.3Annexin Ⅴ-FITC/PI染色檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期的HuCCT1細胞接種于35 mm 培養(yǎng)皿，待細胞長到70%左右融合時，給予對照組和用藥組0、100、200和400 nmol/L的AZD8055工作液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，誘導細胞凋亡。陽性對照組加入100 μmol/L的H2O2處理6 h。常規(guī)消化收集細胞，進行Annexin V-FITC和PI染色，用流式細胞儀進行檢測。

2.4Western blot實驗 分別用0、100、200和400 nmol/L的AZD8055處理HuCCT1細胞 24 h，用T-PER蛋白提取液(Invitrogen)提取細胞總蛋白，40 μg蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)至PVDF上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，加 I 抗[Bax (1∶1 000)、Bcl-2 (1∶1 000)、cleaved caspase-3 (1∶1 000)、LC3 (1∶1 000)、beclin 1 (1∶1 000)、p62 (1∶1 000)和β-actin (1∶3 000) ] 4 ℃過夜，加HRP標記的 II 抗室溫孵育1 h，ECL顯色發(fā)光檢測。

2.5吖啶橙染色 細胞接種于6孔帶蓋玻片細胞培養(yǎng)板中，用200 nmol/L的AZD8055分別處理6 h和24 h，用吖啶橙染色15 min，具體操作方法參照說明書，封片后拍照觀察。

3 統(tǒng)計學處理

本研究所有數(shù)據(jù)用SPSS 20.0和GraphPad Prism 5軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示；多組間數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析，各組均數(shù)間的兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 AZD8055顯著抑制膽管癌細胞HuCCT1的細胞活力

膽管癌細胞HuCCT1經(jīng)0、50、100、200和400 nmol/L AZD8055作用24 h、72 h和120 h后，與對照組相比，在同一時點不同濃度AZD8055可顯著抑制膽管癌細胞的活力(P<0.05)，提示AZD8055對膽管癌細胞具有抑制細胞活力的作用，見圖1。

Figure 1. The effects of AZD8055 at different concentrations for different time on the cell viability were measured by MTT assay. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group at the same time point.

圖1AZD8055抑制HuCCT1細胞的活力

2 AZD8055誘導膽管癌細胞HuCCT1的細胞自噬

吖啶橙染色后發(fā)現(xiàn)，AZD8055處理后，HuCCT1細胞中橙紅色酸性自噬泡明顯增多，見圖2A。Western blot法檢測自噬相關(guān)蛋白p62、LC3和beclin 1蛋白表達的結(jié)果顯示，與對照組相比，AZD8055作用于膽管癌細胞24 h后，隨著藥物濃度的增加，beclin 1的表達上調(diào)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值逐漸增高，p62的表達下調(diào)(P<0.05,P<0.01)，提示AZD8055可明顯誘導膽管癌細胞自噬，見圖2B。

Figure 2. AZD8055 induced autophagy in the HuCCT1 cells. A: AO staining of autophagosomes after treated with 200 nmol/L AZD8055 in HuCCT1 cells (×400). The green fluorescence shows where the dye had stained the DNA and cell cytoplasm, and the red fluorescence indicated autophagosome formation. B: the effects of AZD8055 on the expression levels of autophagy-related proteins in the HuCCT1 cells were detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖2AZD8055誘導HuCCT1細胞自噬

3 AZD8055對膽管癌細胞HuCCT1細胞凋亡的影響

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，AZD8055用藥組的細胞凋亡率與對照組相比明顯降低(P<0.05),見圖3A。Western blot結(jié)果顯示，抑凋亡因子Bcl-2表達顯著上調(diào)，促凋亡因子Bax下調(diào)，cleaved caspase-3表達下調(diào)(P<0.05)，提示AZD8055可抑制膽管癌細胞凋亡，見圖3B。

討 論

PI3K/Akt/mTOR 信號通路在膽管癌中有異常的活化。近年來,PI3K/Akt/mTOR 通路因其在腫瘤中的重要角色而引起人們關(guān)注。AZD8055作為mTOR雙重分子靶向抑制劑對乳腺癌、結(jié)腸癌和頭頸部腫瘤等多種腫瘤細胞具有抑制作用[10-12]。本研究結(jié)果顯示，AZD8055有效抑制膽管癌細胞的活力，提示AZD8055可抑制膽管癌的異常生長。

Figure 3. AZD8055 inhibited the apoptosis of the HuCCT1 cells. A: HuCCT1 cells treated with AZD8055 were stained with Annexin V-FITC/PI and analyzed by flow cytometry; B: the effects of AZD8055 on the expression levels of apoptosis-related proteins in the HuCCT1 cells were detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖3AZD8055抑制HuCCT1的細胞凋亡

自噬是細胞將自身胞質(zhì)內(nèi)的蛋白或細胞器包被后，與溶酶體融合形成自噬小體，進而降解其內(nèi)容物實現(xiàn)細胞器更新和物質(zhì)代謝的過程。當細胞發(fā)生自噬時，分布在胞漿中的LC3-I會在ATG作用下與磷脂酰乙醇胺共價結(jié)合，轉(zhuǎn)變?yōu)長C3-II并轉(zhuǎn)移至自噬體膜上，因此，LC3-II/I比值的大小可估計自噬水平的高低。p62蛋白可偶聯(lián)于LC3，參與自噬體的構(gòu)成，在自噬的中晚期被降解。張?zhí)鞁傻萚13]證實雷公藤甲素誘導結(jié)腸癌細胞發(fā)生自噬時，p62的表達下調(diào)。本結(jié)果發(fā)現(xiàn)AZD8055用藥后，細胞內(nèi)酸性自噬泡明顯增多，自噬標識蛋白beclin 1蛋白表達量上調(diào)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值逐漸增高，p62表達下調(diào)，說明AZD8055可通過誘導膽管癌細胞自噬進而誘導細胞死亡。

凋亡和自噬在腫瘤的研究中具有明顯的相關(guān)性，但兩者之間有時候自相矛盾。有研究發(fā)現(xiàn)[14-15]，PI3K/Akt/mTOR通路被抑制后，凋亡和自噬可協(xié)同抑制腫瘤存活。但有研究發(fā)現(xiàn)[16]，PI3K/Akt/mTOR抑制劑的抗增殖作用主要通過誘導自噬，而非凋亡作用。近年來，有研究認為這種通路的抑制會誘發(fā)自噬，使癌細胞免受化療藥物的作用并延緩腫瘤細胞凋亡。但部分研究者認為，抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路可通過誘導大量細胞自噬，增強腫瘤的放射敏感性，抑制腫瘤的異常生長[17]。Hu等[18]研究表明，AZD8055主要通過誘導肝癌細胞自噬來誘導細胞死亡而非細胞凋亡途徑。本研究結(jié)果也顯示，抑凋亡蛋白Bcl-2上調(diào)，促凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3下調(diào)，說明AZD8055抑制膽管癌細胞凋亡，流式細胞術(shù)的檢測結(jié)果同樣驗證了以上觀點。

綜上所述，AZD8055可抑制膽管癌細胞增殖能力，其作用機制是通過誘導細胞自噬來實現(xiàn)的，提示AZD8055有望成為新一代治療膽管癌的分子靶向藥物。

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