楊國華 鄭圣斌 林彩鋒 黃若磊

結直腸癌發(fā)病率為惡性腫瘤第三位，病死率位居惡性腫瘤第四位，常見死亡原因為腫瘤復發(fā)或轉移。近年來，國內外學者研究發(fā)現結直腸癌組織中存在一群細胞表面表達CD133的亞組癌細胞，含有該組癌細胞的腫瘤組織其復發(fā)率及轉移率明顯升高。外周循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cell,CTC)指外周循環(huán)血液中的腫瘤細胞，學者研究[1-2]發(fā)現CTC數量與病人預后呈負相關，數量越多其預后越差。結直腸癌預后判斷一直是結直腸癌臨床研究熱點，本文擬對CD133聯合CTC兩因素在結直腸癌預后評估應用的可行性作一研究。

資料與方法

一、一般資料

收集自2012年1月至2013年1月福建省立醫(yī)院胃腸外科及腫瘤外科132例結直腸癌手術標本，年齡為(52.7±13.9)歲，年齡范圍為35～86歲。132例均行術前腸鏡及術后標本病理證實，其中高分化29例，中分化72例，低分化31例；按美國國立綜合癌癥網絡(NCCN)指南2016年第2版TNM分期Ⅰ期26例，Ⅱ期32例，Ⅲ期51例，Ⅳ期23例。

二、隨訪方法及內容

采取病人門診隨訪及電話隨訪，術后前2年每3個月復查，第3年每半年復查，復查內容：血常規(guī)、生化、癌胚抗原(CEA)、CTC，胸片、腹部B超；每半年復查全腹及胸部CT，每年復查腸鏡。

三、標本組織中CD133測定

10%甲醛溶液固定新鮮組織標本，連續(xù)薄切厚4 μm病理切片共3張，常規(guī)病理HE染色，采用ABC法行免疫組織化學病理染色。步驟如下：切片常規(guī)脫蠟后用梯度乙醇水化，3%H2O2滅活內源性過氧化物酶，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后加入一抗鼠抗人CD133單克隆(1∶40)，用二氨基聯苯胺(DAB)顯色后加入蘇木精復染，樹脂封片。參考文獻[3]標準：CD133陽性表達為境界清晰、突出于背景的棕黃色，定位于細胞質、細胞膜同時呈棕黃色亦為陽性。計分標準參照Hilbe等[4]的方法，隨機選取4個高倍視野約200個細胞，計數腫瘤細胞CD133陽性數，取三張陽性切片平均值作為計數結果，細胞數>10%為陽性，≤10%為陰性。

四、CTC測定

術前采外周血10 ml，置于50 ml離心管中1 500 r/min離心，后加入CS1血小板裂解液45 ml后再次離心，去除血清等上清至12 ml，搖勻加入CS2紅細胞裂解液裂解紅細胞，離心去除上清，留下白細胞與特種細胞沉淀，加300 μl CS1搖勻沉淀細胞，加入磁微粒吸附離心，去除結合白細胞的磁微粒沉淀。再次離心去上清至100 μl，加CF1混勻細胞懸液涂片，置25℃～33℃無風烘箱烘干。染色鑒定：將細胞干片加CF2固定液固定8 min后，浸泡SSC試劑10 min后，加入雜交探針，放入雜交儀雜交1.5 h后，取出浸泡43℃預熱后的甲酰胺試劑15 min，再次浸泡SSC試劑10 min，用BSA清洗標本區(qū)后加入CD45孵育1 h后取出加入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPA)染色，蓋上蓋玻片，放置4℃冰箱保存。最后使用熒光顯微鏡先在藍色通道下找到靶細胞層面，換到20倍物鏡，分別在三種通道(藍色、紅色、橙色或綠色)下觀看信號、細胞狀態(tài)、CD45著色等情況。CTC細胞表現為：單個細胞狀態(tài)，核質均勻，未發(fā)現分層，細胞表面無或僅一顆結合白細胞磁微粒；紅色通道下未見CD45紅色，CD45陰性。橙色或綠色信號3個或3個以上，且在細胞核上。我們參考文獻[5]標準：CTC>3個/7.5 ml為高水平量(H-CTC)，≤3個/7.5 ml為低水平量(L-CTC)。

五、觀察指標

觀察CD133、CTC與臨床病理各因素之間的關系，并進一步將實驗分為4個組，第1組為CD133陰性(CD133-)L-CTC，第2組為CD133-H-CTC，第3組為CD133陽性(CD133+)L-CTC，第4組為CD133+H-CTC，繪制各組的3年生存曲線。

六、統(tǒng)計學分析

結 果

一、隨訪情況

本組完整隨訪了124例，失訪8例；隨訪病例中CD133-L-CTC共59例，CD133-H-CTC共21例，CD133+L-CTC共35例，CD133+H-CTC共9例。

二、臨床各因素與CD133、CTC之間的關系

CD133陽性組與CD133陰性組病人在淋巴結轉移、遠處轉移、腹膜種植、組織分化、神經脈管侵犯等因素方面比較，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)；而在結腸癌位置(P=0.755)、病人性別(P=0.069)、年齡(P=0.697)、腫瘤浸潤深度(P=0.231)、CEA水平(P=0.054)方面兩組差異均無統(tǒng)計學意義。CTC高水平量組與CTC低水平量組病人在腫瘤位置、腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移、腹膜種植、組織分化、神經脈管侵犯等因素方面比較，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。(表1)

三、各組生存曲線關系

CD133-L-CTC組生存時間與CD133+L-CTC組之間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.452)；但明顯高于CD133-H-CTC 組(P=0.037)及CD133+H-CTC

表1 臨床各因素與CD133、CTC之間的關系(例)

組(P<0.01)；CD133+L-CTC組生存時間明顯高于CD133-H-CTC組(P=0.042)及CD133+H-CTC組(P<0.01)；CD133-H-CTC組生存時間明顯高于CD133+H-CTC組，兩組之間差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.035)。(表2、圖1)

表2 各組生存時間及95%可信區(qū)間(d)

注：與CD133-L-CTC組比較，aP<0.05；與CD133-H-CTC組比較，bP<0.05；與CD133+L-CTC組比較，cP<0.05

四、CTC鏡下特征

CTC在鏡下表現：細胞呈單個細胞狀態(tài)，核質均勻，紅色通道下未見CD45紅色，CD45陰性。橙色或綠色信號3個或3個以上，且在細胞核上。(圖2、3)

圖1 4組3年生存曲線圖

圖2 CTC在熒光顯微鏡(×40)鏡下表現 A．CTC單個細胞狀態(tài)，細胞核上呈3個橙色及1個綠色信號，核質均勻，CD45陰性，未見紅色；B．CTC單個細胞狀態(tài)，細胞核上呈3個橙色及2個綠色信號，核質均勻，CD45陰性，未見紅色

圖3 CD133免疫組織化學染色切片(×20) CD133陽性表達為境界清晰、突出于背景的棕黃色(箭頭所示)，定位于細胞質、細胞膜

討 論

結直腸癌是全球腫瘤死亡的主要原因之一，其致死的主要原因為腫瘤復發(fā)或轉移，大約有15%～25%的病人就診時同時合并肝轉移，25%～50%在原發(fā)灶切除術后發(fā)生肝轉移[6-7]。本研究發(fā)現：結直腸癌組織中CD133陽性與腫瘤淋巴結轉移、遠處轉移、腹膜種植、組織分化、神經脈管侵犯明顯相關。這可能與CD133表達上調在結直腸癌中增高肝轉移率，其預后更差;學者研究表明對于結直腸癌CD133陽性干細胞樣細胞，它們與結直腸腫瘤的侵襲和分化呈正相關[8-11]。本研究還發(fā)現，CD133陽性與陰性病人在術后3年內二者生存曲線無明顯差異，但術后2年時CD133陽性病人其生存時間開始低于CD133陰性組，遠期生存時間有待進一步隨訪。

近年來國內外學者從結直腸癌肝轉移病人外周血發(fā)現CTC，血液中CTC的分子表征提供了替代或補充的非侵入性方法組織活檢[12-13]；CTC可作為結直腸癌伴肝轉移病人的獨立預后因素，CTC陽性組的總生存期及無病生存期明顯低于陰性組[14]。本研究結果表明：CTC數量與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移、腹膜種植、組織分化、神經脈管侵犯呈明顯正相關，而上述幾個因素是結直腸癌術后預后不良主要因素[15]；本研究結果表明：CTC低水平量組其3年生存期明顯好于高水平量組，CD133-L-CTC組生存時間為(1 002.8±39.1) d，CD133+L-CTC-組為(980.5±38.8) d，明顯高于CD133-H-CTC組的(782.5±75.8) d及CD133+H-CTC組的(368.6±31.0) d，差異均具有統(tǒng)計學意義，說明CTC高水平的結直腸癌預后差，其原因與上述結直腸癌預后不良因素相關。本研究還發(fā)現，CTC還與腫瘤位置有關，左半結腸CTC水平明顯高于右半結腸，兩組比較差異具有統(tǒng)計學意義。這與臨床左半結腸癌預后明顯差于右半結腸相符，其具體分子機制目前尚不明，有待進一步分子機制研究。

通過本研究表明，CD133聯合CTC可用于結直腸癌術后3年生存時間評估，CD133陰性且CTC低水平量組預后好，而CD133陽性且CTC高水平量組預后差。CD133可能與病人3年生存期無明顯相關，可能與遠期生存時間有關；而CTC水平與病人近期生存時間明顯相關。其遠期預后評估有待一步隨訪。

1 Rahbari NN, Aigner M, Thorlund K, et al. Meta-analysis shows that detection of circulating tumor cells indicates poor prognosis in patients with colorectal cancer. Gastroenterology,2010,138:1714-1726.DOI:10.1053/j.gastro.2010.01.008.

2 Groot Koerkamp B, Rahbari NN,Buchler MW,et al.Circulating tumor cells and prognosis of patients with resectable colorectal liver metastases or widespread metastatic colorectal cancer: a meta-analysis. Ann Surg Oncol,2013,20:2156-2165.DOI:10.1245/s10434-013-2907-8.

3 Mia J,So YJ,Kim IU,et al.CD133 expression is not an independent prognostic factor in stage II and III colorectal cancer but may predict the better outcome in patients with adjuvant therapy.BMC cancer,2013,5:166-176.DOI: 10.1186/1471-2407-13-166.

4 Hilbe W,Dimhofer S,Oberwasserlechner F,et al.CD133 positive endothelial progenitor cells contribute to the tumour vasculature in non-small cell lung cancer.J Clin Pathol,2004,57:965-969.DOI:10.1136/jcp.2004.016444.

5 Matsusaka S,Suenaga M,Mishima Y,et al.Circulating tumor cells as a surrogate marker for determining response to chemotherapy in Japanese patients with metastatic colorectal cancer. Cancer Sci,2011,102:1188-1192.DOI:10.1111/j.1349-7006.2011.01926.

6 Jemal A,Bray F,Center MM,et al. Global cancer statistics. CA Cancer J Clin,2011,61:69-90.DOI:10.3322/caac.20107.

7 Pawlik TM，Choti MA. Surgical therapy for colorectal metastases to the liver. Gastrointest Surg,2007,11:1057-1077.

8 Lim SH,Jang J,Park JO,et al. CD133-positive tumor cell content is a predictor of early recurrence in colorectal cancer.Gastrointest Oncol,2014,5:447-456. DOI: 10.3978/j.issn.2078-6891.2014.071.

9 Kishikawa J,Kazama S, Oba K,et al.CD133 Expression at the metastatic site predicts patients' outcome in colorectal cancer with synchronous liver metastasis.Ann Surg Oncol,2016,23:1916-1923.DOI:10.1245/s10434-016-5099-1.

10Kazama S,Kishikawa J,Yasuda K,et al.CD133 expression in lymph node metastases is associated with tumor aggressiveness during lymph node metastasis in colorectal cancer.Anticancer Res,2015,35:6599-6605.

11Chen S,Song X,Chen Z,et al.CD133 expression and the prognosis of colorectal cancer:a systematic review and meta-analysis.PLoS One,2013,8:e 56380.DOI:10.1371/journal.pone.0056380.

12Maheswaran S,Haber DA.Circulating tumor cells:a window into cancer biology and metastasis.Curr Opin Genet Dev,2010,20:96-99.DOI: 10.1016/j.ajpath.2010.12.003.

13Devriese LA,Voest EE,Beijnen JH,et al.Circulating tumor cells as pharmacodynamic biomarker in early clinical oncological trials.Cancer Treat Rev,2011,37:579-589.DOI:10.1016/j.ctrv.2011.04.006.

14Groot KB,Rahbari NN,Büchler MW,et al.Circulating tumor cells and prognosis of patients with resectable colorectal liver metastases or widespread metastatic colorectal cancer: a meta-analysis.Ann Surg Oncol,2013,20:2156-2165.DOI:10.1245/s10434-013-2907-8.

15Hinz S,Hendricks A,Wittig A,et al.Detection of circulating tumor cells with CK20 RT-PCR is an independent negative prognostic marker in colon cancer patients - a prospective study.BMC Cancer,2017,17:53-64.DOI:10.1186/s12885-016-3035-1.