楊 杰

0 引言

干擾素(Interferon,IFN)是人體細(xì)胞分泌的一種活性蛋白質(zhì)，具有廣譜的抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用，是人體預(yù)防系統(tǒng)的重要組成部分[1-2]。根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)和抗原性的差異分為α、β、γ、ω 4種類(lèi)型。α型干擾素根據(jù)結(jié)構(gòu)的不同再分為α-1b、α-2a、α-2b，其中α-2b型干擾素是我國(guó)臨床上使用較多的一種。目前，干擾素由于其抗病毒作用強(qiáng)，抗病毒譜廣，在我國(guó)臨床上已廣泛應(yīng)用于治療各種病毒感染所致的疾病，其中以治療病毒性肝炎的臨床應(yīng)用最多、用量最大。在我國(guó)，各型病毒性肝炎均存在，尤其以乙型肝炎感染率最高、危害最大。目前，應(yīng)用干擾素治療乙型肝炎非常重要。

臨床已批準(zhǔn)使用的干擾素劑型主要有注射用凍干粉針、溶液型注射劑等普通劑型。由于干擾素如其他類(lèi)細(xì)胞因子一樣，其體內(nèi)、外穩(wěn)定性差，進(jìn)入體液后易被體內(nèi)的酶系統(tǒng)破壞失活，體內(nèi)生物半衰期短，同時(shí)，干擾素吸收后在體內(nèi)分布于全身，缺乏靶向性，到達(dá)病灶部位的干擾素的量有限[3]。有報(bào)道，干擾素靜脈注射后，前1 h半衰期僅為15 min。其后3 h為90 min，6 h時(shí)血清中已檢測(cè)不到藥物水平。因此，臨床需大劑量、頻繁給藥，同時(shí)毒副作用、不良反應(yīng)也隨之增大[4]。

脂質(zhì)體是由類(lèi)脂質(zhì)雙分子組成的類(lèi)似生物膜結(jié)構(gòu)的封閉囊泡，是近年來(lái)研究較多的新型藥物載體。脂質(zhì)體作為蛋白多肽類(lèi)藥物的載體，具有提高藥物體內(nèi)穩(wěn)定性、延緩藥物釋放、延長(zhǎng)生物半衰期、提高生物利用度的作用[5]。因此，研究開(kāi)發(fā)重組人干擾素α-2b脂質(zhì)體注射劑，利用脂質(zhì)體載體的特點(diǎn)，以期達(dá)到延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的存留時(shí)間，提高肝靶向和療效的目的，具有重要意義。本文制備了重組人干擾素α-2b脂質(zhì)體，以溶液作為參比，考察重組人干擾素α-2b脂質(zhì)體家兔肌肉注射給藥體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的變化。

1 儀器與材料

DG-5031酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(南京華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限公司)；TGL-16G離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；CSL120GXL超速離心機(jī)(日本 Hitachi koko co.,Ltd)；LS230 激光粒度分析儀(美國(guó)BECKMAN)。

重組人干擾素α-2b(北京斯諾爾生物技術(shù)有限公司提供)；人干擾素α定量酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒(進(jìn)口分裝，北京東方試劑公司)；Triton X-100 (FARCO CHEMICAL SUPPLIES HONG KONG)；大豆磷脂(SPC,Lipiod GmbH，Ludwigshafen Germany)；膽固醇(Cholesterol,Chol，廣州試劑公司，進(jìn)口分裝)；其余試劑為分析純。

新西蘭種白兔,雄性，體重2.0～3.0 kg，由沈陽(yáng)市東陵區(qū)龍?jiān)B(yǎng)殖場(chǎng)提供，合格證號(hào)：SCXK(遼)2003-0013號(hào)。

2 方法

2.1 重組人干擾素α-2b脂質(zhì)體的制備及表征 稱(chēng)取磷脂、膽固醇(摩爾比2∶1)組分溶解于乙醚中，用磷酸鹽緩沖液配制含一定濃度的rhIFN α-2b溶液作為水相，加入白蛋白作為穩(wěn)定劑，水相與有機(jī)相以一定比例混合，冰浴超聲形成W/O乳劑，減壓除去有機(jī)溶劑，氮?dú)饬骼^續(xù)吹干使形成膠態(tài)狀，用磷酸鹽緩沖液40 ℃水化，超聲形成小單室脂質(zhì)體,超濾后,過(guò)0.22 μm微孔濾膜，即得。采用超速離心法測(cè)定脂質(zhì)體包封率。取干擾素脂質(zhì)體樣品適量，以水為分散介質(zhì)，用LS230激光粒度分析儀(Beckman Coulter)測(cè)定脂質(zhì)體的粒度及其粒度分布。

2.2 重組人干擾素α-2b脂質(zhì)體與溶液劑家兔肌肉注射給藥體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)

2.2.1 血漿樣品處理方法 精密量取血漿樣品200 μL，加入含0.3% Triton X-100的試劑盒樣品稀釋液，稀釋至樣品濃度在測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，采用 ELISA法測(cè)定藥物濃度。

2.2.2 雙抗體夾心ELISA法測(cè)定血漿重組人干擾素α-2b濃度 用抗人干擾素α (IFN-α)單抗體包被于酶標(biāo)板上，每孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100 μL，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的IFN-α與單抗體結(jié)合，加入酶標(biāo)記的抗人IFN-α抗體，形成免疫復(fù)合物連接在板上，洗滌，去除過(guò)量結(jié)合物，再加入酶底物OPD，出現(xiàn)黃色，加入終止液硫酸，顏色變深，呈色與IFN-α抗體復(fù)合物結(jié)合物量成正比。在492 nm處測(cè)定的OD值與樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中的IFN-α呈正比。用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算測(cè)定樣品濃度。

2.2.3 藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)方案 取家兔6只，隨機(jī)分成2組，每組3只，其中實(shí)驗(yàn)組于左后腿部肌肉注射重組人干擾素α-2b脂質(zhì)體(250萬(wàn)IU/kg),對(duì)照組于左后腿部肌肉注射重組人干擾素α-2b溶液(250萬(wàn)IU/kg),給藥后實(shí)驗(yàn)組于0.8、1.2、2.17、3.33、4、6.25、8、12、24 h取血，對(duì)照組于0.5、1.4、2、3、4、6、8、12、24 h取血，置涂有肝素的離心管中，離心10 min(3 000 r/min),取出血漿，-80 ℃保存，待測(cè)。

2.3 數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)距法計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，并通過(guò)t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。

3 結(jié)果

3.1 重組人干擾素α-2b脂質(zhì)體的制備及表征 本文采用逆向蒸發(fā)法制備的重組人干擾素α-2b脂質(zhì)體外觀為半透明溶液，其藥物包封率為84%，粒徑130 μm(SD 1.146)，90%的粒子小于156 μm。

3.2 藥動(dòng)學(xué)研究 本文采用ELISA法測(cè)定血漿及組織中藥物濃度，經(jīng)過(guò)特異性、回收率、精密度等含量分析方法學(xué)驗(yàn)證，證明本法適用于家兔體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究，確定線性范圍：32～2 000 pg/mL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：lgA=0.929 7 lgC-2.620 1，r2=0.980 6。

重組人干擾素α-2b脂質(zhì)體及重組人干擾素α-2b溶液家兔肌肉注射體內(nèi)血漿藥物濃度-時(shí)間圖見(jiàn)圖1，利用統(tǒng)計(jì)法求算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，見(jiàn)表1。

結(jié)果表明，與溶液劑相比，重組人干擾素α-2b脂質(zhì)體延緩了藥物的吸收，達(dá)峰時(shí)間Tmax由1.42 h延長(zhǎng)至2.27 h，而峰濃度類(lèi)似(14 283.7 pg/mL vs.15 000.0 pg/mL)，體內(nèi)平均滯留時(shí)間(MRT)分別為4.86 h和6.00 h，脂質(zhì)體組體內(nèi)滯留時(shí)間較溶液劑組延長(zhǎng)。體內(nèi)消除半衰期分別為4.13 h和4.17 h(P<0.01)。血藥濃度曲線下面積(AUC0-∞)分別為73 902.7 pg/(mL·h)和103 323.3 pg/(mL·h)，脂質(zhì)組AUC為溶液劑組的1.4倍，體內(nèi)生物利用度顯著提高(P<0.05)。

圖1 家兔肌肉注射重組人干擾素α-2b脂質(zhì)體及重組人干擾素α-2b溶液體內(nèi)血漿藥物濃度-時(shí)間曲線圖

表1 家兔肌肉注射重組人干擾素α-2b脂質(zhì)體及重組人干擾素α-2b溶液藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

注：與重組人干擾素α-2b溶液組比較，*P<0.05,**P<0.01

4 討論

已有文獻(xiàn)報(bào)道，逆相蒸發(fā)法適用于包裹水溶性大分子生物活性物質(zhì)，通過(guò)該方法可以獲得藥物包封率較高的脂質(zhì)體，但逆向蒸發(fā)法需要使用有機(jī)溶劑與含有藥物的水相性形成W/O，對(duì)于生物活性蛋白干擾素遇有機(jī)溶劑可能產(chǎn)生失活的問(wèn)題。本文采用人血白蛋白作為活性穩(wěn)定劑，其首先吸附在油水界面上，避免了藥物的界面吸附和失活，起到了良好的穩(wěn)定作用。

目前，蛋白多肽類(lèi)藥物的藥動(dòng)學(xué)研究方法有同位素示蹤法、ELISA法和生物檢定法。ELISA法檢測(cè)藥物濃度，具有簡(jiǎn)單、方便、快速、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，因此，本文采用ELISA法測(cè)定血漿及組織中藥物濃度，經(jīng)過(guò)特異性、回收率、精密度等含量分析方法學(xué)驗(yàn)證，證明本法適用于家兔體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究，確定線性范圍：32～2 000 pg/mL。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：lgA=0.929 7 lgC-2.620 1，r2=0.980 6。

已有文獻(xiàn)報(bào)道了重組人干擾素α-2b脂質(zhì)體肌肉注射小鼠或大鼠的藥動(dòng)學(xué)過(guò)程，但家兔體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)鮮有報(bào)道。本文制備了穩(wěn)定重組人干擾素α-2b脂質(zhì)體，并對(duì)其家兔體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行了比較性研究，以期為重組人干擾素α-2b脂質(zhì)體制劑的研究提供更加廣泛的動(dòng)物體內(nèi)數(shù)據(jù)。

結(jié)果表明，與參比制劑溶液劑相比，脂質(zhì)體顯著改變了重組人干擾素α-2b家兔肌肉注射給藥的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)行為，使其吸收延長(zhǎng)，達(dá)峰時(shí)間延長(zhǎng)，體內(nèi)平均滯留時(shí)間增加，AUC顯著提高。脂質(zhì)體可作為重組人干擾素α-2b的潛在給藥系統(tǒng)。

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