馮清林，范仕兵，趙 銳，宋 毅，冉住國，劉明冬，李 驥

0 引言

癲癇是一種不同病因引起的反復發(fā)作的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，全球大約有9 000萬的患者，發(fā)病率約為5%，其發(fā)病原因主要是大腦中的神經(jīng)元突然出現(xiàn)異常的電脈沖[1-2]。目前的治療手段仍然是以藥物為主，且1/3的患者對藥物治療效果差，導致發(fā)展為難治性癲癇[3]。癲癇發(fā)作后，線粒體是生產(chǎn)自由基的重要場所，同時也是氧化應(yīng)激損傷的靶點。線粒體的損傷將導致腦組織ATP水平下降、神經(jīng)元電活動紊亂，從而使神經(jīng)元凋亡過程啟動，加重癲癇造成的神經(jīng)損傷，細胞凋亡又反過來易化癲癇發(fā)作[4-5]。目前研究發(fā)現(xiàn)，氫分子具有抗氧化作用，可以清除自由基。在動物實驗中，氫氣可有效清除自由基，改善腦及心肌缺血再灌注損傷；有效減輕小腸移植后的炎癥損傷等[6-8]。通過這些研究，我們推測氫主要與神經(jīng)元內(nèi)源性凋亡途徑相關(guān)，具有抗氧化、抗炎、抑制凋亡等作用。我們提出假設(shè)：氫對癲癇發(fā)病有治療作用，并且有著不良反應(yīng)小、價格低廉的優(yōu)點。因此，本研究探討了飽和氫生理鹽水(Saturated hydrogen saline，SHN)對癲癇大鼠腦保護作用及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物模型 30只健康6～8周齡SPF清潔級雄性SD大鼠，體重200～240 g，由重慶醫(yī)科大學動物實驗中心提供，動物許可證號：SCXK(渝2016-0001)。在室溫(23±2) ℃、濕度為55%±5%，12 h晝/夜循環(huán)照明的環(huán)境下飼養(yǎng)。所有操作過程遵循實驗動物倫理學要求，隨機分為健康對照組(NC組)、SE組、SHN干預(yù)組。致癇模型前1 d即用SHN干預(yù)，對照組及SE組予以等量生理鹽水，給藥方式為腹腔注射1次/d (10 mL/kg)。致癇后第2～6天進行Morris水迷宮行為訓練及測試，結(jié)束后予以斷頭處死并取雙側(cè)海馬組織，-80 ℃低溫保存。

1.1.2 飽和氫生理鹽水的制備[9]采用氫水生成設(shè)備(ver.2，Blue Mercury Inc.Tokyo，Japan)高壓下(0.4 Mpa)將分子氫溶于生理鹽水制成飽和溶液。制備好的飽和氫溶液儲存于鋁制包裝內(nèi)，保證將氫濃度維持在>0.6 mmol/L，每周均新鮮配置。

1.1.3 試劑 氯化鋰及匹羅卡品(購自Sigma公司)，SOD、GSH-Px、CAT、MDA、IL-1β、TNF-α檢測試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)；一抗：兔抗Bcl-2、Bax、caspase-3多克隆抗體(sc783、sc-6236、sc-7148，Santa Cruz)；β-actin (sc-130656 Santa Cruz)；二抗：山羊抗兔IgG(bs-0295G，北京博奧森公司)；其余試劑為市售分析純品。

1.2 方法

1.2.1 癲癇模型建立 采用氯化鋰-匹羅卡品腹腔注射法建立顳葉癲癇模型[10]，大鼠腹腔注射氯化鋰3 mmol/kg，20 h后再腹腔注射新鮮配置的匹羅卡品30 mg/kg，給藥后大鼠在15～45 min 后形成癲癇持續(xù)狀態(tài)。根據(jù)經(jīng)典的 Racine 癲癇發(fā)作行為標準進行觀察記錄[11]。模型組動物發(fā)作級別均達Ⅳ級以上，在癲癇持續(xù)狀態(tài)60 min后，腹腔注射地西泮4 mg/kg，終止癲癇持續(xù)狀態(tài)(Status epilepticus，SE)。

1.2.2 Morris水迷宮試驗方法檢測大鼠定位航行能力及空間探索能力 水迷宮儀器為直徑140 cm、高60 cm的圓形水池，控制水溫在(25±1) ℃，水池等分為4個象限，在第1象限正中距離池壁30 cm處放一透明圓形平臺(直徑10 cm)，同時將水面高于平臺表面1.0 cm。大鼠于致癇后第2天開始測試，4次/d，連續(xù)訓練5 d。將大鼠每次隨機從一個象限面朝池壁輕輕放入水中，記錄大鼠到達平臺所需時間(潛伏期)，允許大鼠在平臺上停留30 s，以強化記憶效果，時間以60 s為限，如大鼠在60 s內(nèi)未達到平臺，則逃避潛伏期以60 s記錄，并由實驗員引導至平臺停留30 s?？臻g探索實驗：致癇后第7天進行測試，移除平臺，從大鼠前5 d的入水點放入，持續(xù)120 s，記錄大鼠在隱藏平臺所在象限的停留時間。

1.2.3 各組海馬組織氧化還原反應(yīng)指標及炎癥指標 大鼠在完成Morris水迷宮實驗之后，麻醉后予以斷頭處死，在冰浴上開顱并迅速取雙側(cè)大腦海馬組織，電子天平稱重，低溫條件下勻漿后，在4 ℃離心機中4 000 r/min離心10 min，并取上清液，按照試劑盒說明測定氧化還原指標SOD、GSH-Px、CAT、MDA及炎癥指標IL-1β、TNF-α。

1.2.4 Western blot檢測各組海馬組織中Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白水平 將保存在-80 ℃冰箱的蛋白標本，65 ℃加熱，每條泳道加樣50 μg蛋白，用10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上予以脫脂奶粉封閉后，分別加入一抗(1∶1 000)、二抗(1∶2 000)孵育，并予以ECL發(fā)光試劑顯色及Tanon凝膠圖像分析系統(tǒng)照相并分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 實驗動物癲癇模型情況 大鼠注射匹羅卡品后15～45 min出現(xiàn)煩躁、點頭、節(jié)律性咀嚼及洗臉樣動作，繼之出現(xiàn)雙前肢陣攣或后肢伸展，然后出現(xiàn)四肢抽搐，反復強直-陣攣發(fā)作，達到Racine癲癇發(fā)作行為標準Ⅳ級，符合SE。

2.2 大鼠Morris水迷宮試驗 隨著訓練時間的增加，大鼠尋找平臺潛伏期時間逐漸縮短。各組大鼠從測試第2天開始，SE組大鼠尋找平臺潛伏期時間較NC組延長，SHN干預(yù)組大鼠尋找平臺潛伏期時間較SE組大鼠縮短(P<0.05)。各組訓練結(jié)束后，SE組大鼠在隱藏平臺象限游泳時間短于NC組，SHN干預(yù)組大鼠在隱藏平臺象限游泳時間較SE大鼠延長(P<0.05)，見表1、表2。

表1 Morris水迷宮定位航行實驗平臺象限游泳時間(n=10)

2.3 各組癲癇大鼠海馬組織中SOD、GSH-Px、CAT、MDA的比較 SE大鼠大鼠海馬組織中氧化還原反應(yīng)指標與NC組比較，SOD、GSH-Px、CAT降低，MDA升高;SHN干預(yù)組大鼠海馬組織中氧化還原反應(yīng)指標與SE組比較，SOD、GSH-Px、CAT升高，MDA降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表2 Morris水迷宮定位航行實驗逃避潛伏期比較(n=10)

表3 各組大鼠海馬組織中氧化還原反應(yīng)酶指標水平比較(n=10)

2.4 各組大鼠海馬組織中IL-1β、TNF-α的比較 與NC組比較，SE大鼠海馬組織中炎癥指標IL-1β、TNF-α升高，與SE組比較，SHN干預(yù)組大鼠炎癥指標比IL-1β、TNF-α降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 各組大鼠海馬組織IL-1β、TNF-α表達比較

2.5 各組大鼠海馬組織中Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達情況 與NC組比較，SE組Bax、caspase-3表達水平及Bax/Bcl-2比值升高(P<0.05)，Bcl-2降低(P<0.05)與SHN干預(yù)組比較，SE組Bax、caspase-3及Bax/Bcl-2比值降低(P<0.05)，Bcl-2升高(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠海馬組織中Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達水平

3 討論

癲癇患者人數(shù)約占全球人口的5%，其中中國約有1 000萬癲癇患者，已經(jīng)給家庭和社區(qū)造成沉重的精神和經(jīng)濟負擔，但癲癇的發(fā)病原因及具體機制目前尚不清楚，外傷性腦損傷、腦出血、顱內(nèi)感染、腦腫瘤、大腦皮質(zhì)異常等導致癲癇[12]，神經(jīng)元異常放電、氧化應(yīng)激、神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)失衡是癲癇發(fā)病的重要機制。目前基礎(chǔ)研究及臨床研究也報道，氧化應(yīng)激、炎性因子及炎癥反應(yīng)參與了癲癇的發(fā)病過程[13-14]。相關(guān)研究證實，氫不僅在抗氧化、抗炎、抗腫瘤等方面發(fā)揮重要作用，而且具有神經(jīng)系統(tǒng)保護作用。有學者在帕金森病、新生兒缺血缺氧性腦病及腦外傷等動物模型中發(fā)現(xiàn)氫具有腦保護作用[15-16]。目前氫分子醫(yī)學已成為一個新的研究熱點，其生物抗氧化作用具有如下優(yōu)點：①氫還原性弱，氫選擇性抗氧化的基礎(chǔ)是只與活性強和毒性強的活性氧反應(yīng)；②人即使呼吸高壓氫也無明顯不良反應(yīng)；③氫與自由基反應(yīng)產(chǎn)物為水，可通過呼吸排出體外；④氫的制備容易，價格低廉[17]。但氫對癲癇的治療作用鮮有報道，因此，本實驗探討了SHN干預(yù)對癲癇大鼠腦保護作用及其可能的機制。

本實驗通過Morris 水迷宮實驗證實癲癇持續(xù)狀態(tài)可使大鼠尋找平臺潛伏期延長，空間探索試驗中SE大鼠在平臺隱藏象限的停留時間縮短，提示學習記憶能力下降，與文獻報道是一致的[18]。SHN干預(yù)后，SE組大鼠這一現(xiàn)象得到明顯改善，結(jié)果提示，SHN能改善癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠的認知功能。研究提示，大腦學習能力與海馬區(qū)功能密切相關(guān)[19]，因此，本研究進一步對海馬組織的氧化還原指標及炎癥指標進行分析。

SOD 是一種肽鏈大分子金屬酶，GSH-Px是一種過氧化物分解酶，CAT是一種催化過氧化氫分解成氧和水的酶，這3種酶的作用均是減少自由基的產(chǎn)生，減少脂質(zhì)過氧化及其代謝產(chǎn)物對機體的損害。MDA是一種氧自由基與生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物[20-21]，其含量可以估計腦組織中氧自由基水平和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的強弱。本研究顯示，與SE組比較，SHN干預(yù)組SOD、GSH-Px、CAT升高，MDA降低，表明SHN可抑制海馬組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護海馬細胞，進而減輕大鼠認知功能損害。癲癇的發(fā)生發(fā)展與免疫調(diào)節(jié)和炎癥密切相關(guān)[13]，IL-1β是急性應(yīng)激反應(yīng)和損傷中的重要炎癥因子，增加IL-1β在大腦中的水平，可能會增加腦組織的炎癥，引起驚厥[22]。TNF-α是一種促炎因子，但很少在正常腦組織中表達，然而在各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，TNF-α水平迅速提升，可能與TNF-α改變了突觸 α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸(AMPA)受體的分子化學劑量，同時增加興奮性突觸的活動有關(guān)[23]。本研究結(jié)果提示，SHN可降低SE組大鼠IL-1β、TNF-α的水平，達到緩解炎癥反應(yīng)、保護海馬細胞的作用。Bcl-2家族蛋白是細胞凋亡過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子，其中Bcl-2蛋白和Bax蛋白相互拮抗，在中樞神經(jīng)元凋亡中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，Bax/Bcl-2比值已成為檢測凋亡的重要指標[24]；caspase-3蛋白是凋亡的最終執(zhí)行者，為凋亡過程中最重要的蛋白酶和多種凋亡途徑的共同下游效應(yīng)部分[25]。本研究Western blot結(jié)果提示：大鼠癲癇發(fā)作后細胞凋亡水平升高，SHN干預(yù)能夠降低SE組大鼠caspase-3活性和Bax/Bcl-2表達水平的上調(diào)，緩解海馬神經(jīng)元的凋亡，改善SE大鼠的氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)。結(jié)果表明，中樞神經(jīng)元的凋亡在癲癇的發(fā)生及發(fā)展中是相關(guān)的。

總之，SHN干預(yù)可改善癲癇后大鼠認知功能障礙、氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)，其機制可能與氫分子作用于Bcl-2、Bax、caspase-3凋亡通路有關(guān)，也可能與Bcl-2、Bax、caspase-3之外的調(diào)控機制相關(guān)，對其機制的研究將是下一步研究的重點。本實驗為預(yù)防或者抗癲癇新型藥物的研制提供新思路。

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