高云西， 陳金峰， 劉可星

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)新肥料資源研究中心實驗室，廣東廣州 510642； 2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研究所，廣東廣州 510640)

當(dāng)前，我國受重金屬污染的耕地面積約為2.0×107hm2，約占耕地總面積的1/5，每年因重金屬污染而損失的糧食約為1.0×107t，受污染糧食多達1.2×107t[1]。有毒重金屬不僅導(dǎo)致土壤肥力與作物產(chǎn)量、品質(zhì)下降，還易引發(fā)地下水污染，并通過食物鏈途徑在植物、動物和人體內(nèi)累積，對生態(tài)環(huán)境、食品安全和人體健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。因此，土壤系統(tǒng)中重金屬的污染和防治一直是國內(nèi)外研究的熱點和難點。生物修復(fù)技術(shù)具有修復(fù)效果好、投資小、費用低、易于管理與操作、不產(chǎn)生二次污染等特點，因而日益受到人們的重視。生物修復(fù)技術(shù)是重金屬污染土壤修復(fù)的研究熱點，包括植物修復(fù)技術(shù)和微生物修復(fù)技術(shù)。生物溶出技術(shù)是微生物修復(fù)技術(shù)中的一種，是利用微生物的直接作用或其代謝產(chǎn)物的間接作用，產(chǎn)生氧化、還原、絡(luò)合、吸附或溶解作用，將固相中某些不溶性成分分離浸提出來的一種技術(shù)[2]。

生物溶出機制主要有酸解作用、絡(luò)合作用、氧化還原作用以及生物累積作用，其中以酸解作用為主[3]。常用的微生物主要分為三大類：化能自養(yǎng)細菌、化能異養(yǎng)細菌、化能異養(yǎng)真菌[4]，黑曲霉作為化能異養(yǎng)真菌，是在代謝分泌有機酸方面最具優(yōu)勢的一類[5]，被眾多研究者用于生物溶出各種介質(zhì)(如土壤、飛灰、污泥、礦渣、廢催化劑等)中的重金屬[6-10]。目前的研究主要關(guān)注黑曲霉對重金屬生物溶出的效果及溶出條件的優(yōu)化，如任婉俠等采用分步溶出的方式，利用黑曲霉溶出工業(yè)污染土壤、污灌農(nóng)田土壤中的重金屬，結(jié)果顯示，二步溶出效果明顯[11]；Gholami等優(yōu)化了黑曲霉的溶出條件，提高了廢催化劑中重金屬的溶出率[12]；Zeng等添加芬頓試劑(Fe2+和H2O2組合體系)后提高了黑曲霉對底泥中重金屬的溶出效果[10]。但是，目前的研究對于生物溶出重金屬形態(tài)的變化，特別是對土壤生物溶出過程中的重金屬形態(tài)變化的報道較少。研究生物溶出土壤重金屬及其過程中的重金屬形態(tài)變化，有利于深入了解土壤重金屬的生物溶出機制，并對于了解重金屬在土壤中的重金屬活性、生物毒性和遷移規(guī)律具有重要意義[10]。

因此，本研究以振蕩搖床培養(yǎng)方式，研究不同碳酸鎘或土壤添加量對黑曲霉溶出重金屬鎘(Cd)的影響，以及黑曲霉溶出土壤重金屬過程中Cd的形態(tài)變化，探討黑曲霉溶出土壤重金屬的可能機制，為生物溶出土壤重金屬技術(shù)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌種：黑曲霉，購自廣東省微生物菌種保藏中心。固體培養(yǎng)基：PDA斜面，主要原料為200 g馬鈴薯(去皮)、20 g蔗糖、18 g瓊脂，加蒸餾水至1 000 mL，自然pH值。液體培養(yǎng)基的配制：100 g蔗糖，0.5 g磷酸二氫鉀，1.5 g硝酸鈉，0.025 g 七水硫酸鎂，0.025 g氯化鉀，1.6 g酵母粉，加蒸餾水至1 000 mL，自然pH值。

固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基均于121 ℃滅菌20 min。

CdCO3，分析純。含Cd土壤，由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所提供，土壤風(fēng)干后，研磨過20目篩保存?zhèn)溆?，其基本理化指?biāo)如下：pH值5.55，有機質(zhì)含量 11.82 g/kg，全氮含量0.161 g/kg，全磷含量34.57 g/kg，全鉀含量18.92 g/kg，Cd含量12.24 mg/kg。

1.2 方法

(1)黑曲霉對CdCO3的溶出試驗。本試驗設(shè)計3個處理，每個處理3次重復(fù)，具體處理內(nèi)容如下：CK0，1 mL孢子溶液，不加碳酸鎘；T1處理，1 mL孢子溶液，7.67 mg碳酸鎘；T2處理，1 mL孢子溶液，15.34 mg碳酸鎘。

分別稱取7.67、15.37 mg CdCO3樣品加入裝有100 mL已滅菌的液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，加入1 mL孢子溶液，孢子數(shù)為1.63×107個/mL，空白對照中加入1 mL無菌水，搖勻后置于往復(fù)式搖床中，30 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng) 5 d。將樣品于5 000 r/min離心10 min，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾。采用原子吸收法測定濾液Cd含量，用高效液相色譜法測定檸檬酸、草酸含量[11]。

高效液相色譜(伍豐LC100，上海)分析的具體參數(shù)如下：色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18，250 mm×4.6 mm；流動相為5 g/L Na2HPO4-H3PO4(pH值=2.8，用磷酸調(diào)節(jié))；流速為0.6 mL/min；柱溫為35 ℃；進樣量為10 μL；DAD檢測器；波長為215 nm。

(2)黑曲霉對含Cd土壤重金屬的溶出試驗。設(shè)3個處理，每個處理3次重復(fù)，具體的處理如下：CK，1 mL孢子溶液，不加土壤；Ta，1 mL孢子溶液，加5.84 g土壤；Tb，1 mL孢子溶液，加11.68 g土壤；Tc，1 mL孢子溶液，加23.36 g土壤。

分別稱取5.84、11.68、23.36 g滅菌土壤樣品加入裝有100 mL已滅菌的液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，加入1 mL孢子溶液，孢子數(shù)為1.80×107個/mL，搖勻后置于往復(fù)式搖床中于30 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)5 d，每個處理3個重復(fù)。

將樣品在5 000 r/min離心10 min，用0.45 μm濾膜過濾，得上清液，測定pH值；用原子吸收法測定上清液中Cd含量，測得的Cd含量與土壤Cd總含量的比值即為金屬溶出率[12]；將沉淀物在80 ℃烘干至恒質(zhì)量后稱質(zhì)量，然后于 600 ℃ 灼燒2 h后再次稱質(zhì)量，計算菌體含量[12]；將沉淀物及原土壤研磨過100目篩，用Tessier連續(xù)提取分級程序法分析測定Cd的形態(tài)變化[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同含量CdCO3對黑曲霉有機酸分泌量和重金屬溶出率的影響

由表1可見，黑曲霉的檸檬酸分泌量在CK0與T1、T2處理間存在顯著差異，但T1、T2處理差異不明顯，說明黑曲霉生產(chǎn)檸檬酸的量與CdCO3有關(guān)，發(fā)酵液中檸檬酸與CdCO3反應(yīng)消耗部分檸檬酸，且Cd對黑曲霉生長產(chǎn)生毒害作用，導(dǎo)致T1、T2處理檸檬酸含量減少。而發(fā)酵液中T2處理的草酸含量與CK0、T1存在顯著差異，T2處理累積草酸量較多。表1中檸檬酸量表現(xiàn)為T1處理>T2處理，而Cd2+溶出率表現(xiàn)為T2處理>T1處理，說明可能由于檸檬酸與CdCO3反應(yīng)，T2處理消耗較多的檸檬酸，從而使T2處理的檸檬酸含量減少，Cd2+溶出率增加；另外，CO32-與H+反應(yīng)，使發(fā)酵液酸性下降，隨著CdCO3添加量的增加，發(fā)酵液的緩沖性加大，因此發(fā)酵液的pH值表現(xiàn)為T2處理>T1處理>CK0。研究表明，檸檬酸和草酸在溶出土壤重金屬過程中，檸檬酸對多種重金屬都有明顯的浸出效果，而草酸與重金屬形成的螯合物穩(wěn)定性較差[13-16]。另外，黑曲霉產(chǎn)生有機酸的種類隨培養(yǎng)條件(如碳源和氮源種類、重金屬濃度、溫度以及pH值等)的改變而改變[17]。當(dāng)發(fā)酵環(huán)境pH值為2.0～4.0時，易產(chǎn)生檸檬酸[3]，而當(dāng)pH值高于4.0時，會使黑曲霉改變代謝途經(jīng)，導(dǎo)致菌體累積草酸等[7]。由于溶液中添加了CdCO3，而CdCO3是碳酸鹽類，容易與溶液中的H+發(fā)生反應(yīng)，改變了發(fā)酵環(huán)境的pH值，使得T1、T2處理累積草酸量較多。

表1 不同發(fā)酵液中的有機酸含量、pH值、Cd2+溶出率

注：表中所示數(shù)值為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”，同列數(shù)據(jù)后標(biāo)有不同小寫字母代表經(jīng)Duncan’s多重比較，差異顯著(α=0.05，n=3)。下表同。

2.2 黑曲霉對土壤中Cd的溶解效果以及形態(tài)變化

2.2.1 發(fā)酵液pH值、重金屬溶出率及菌體干質(zhì)量 由表2可知，發(fā)酵液中CK處理的菌體干質(zhì)量、pH值與其他處理差異顯著，說明不同土壤添加量影響黑曲霉的生長。Tb處理的菌體干質(zhì)量、pH值與Ta、Tc處理也基本存在顯著差異(除Tb處理與Ta處理的pH值差異不顯著)，但Ta處理與Tc處理之間差異不明顯，Cd2+溶出率排序為Tb處理>Ta處理>Tc處理，說明發(fā)酵液中Cd2+溶出率與黑曲霉菌體含量、溶液pH值、土壤添加量等有關(guān)，且當(dāng)溶液pH值為3.11、土壤含量為11.68 g時，溶出效果明顯。楊潔等研究表明，當(dāng)添加飛灰量較高(100 g/L)時，黑曲霉菌體生長緩慢，導(dǎo)致檸檬酸等分泌量減少，影響Cd2+的溶出效果[17]。另外，隨著土壤添加量增加，發(fā)酵液pH值下降的緩沖性增大，也導(dǎo)致Cd2+的溶出率降低，因為生物淋濾修復(fù)主要依賴于酸解機制[11]。

表2 不同發(fā)酵液的pH值、重金屬溶出率及菌體干質(zhì)量

2.2.2 溶出前后土壤Cd形態(tài)變化 由表3可見，黑曲霉對土壤重金屬Cd的可交換態(tài)、碳酸鹽結(jié)合態(tài)、氧化物結(jié)合態(tài)溶出效果較為顯著，但對有機結(jié)合態(tài)、殘渣態(tài)淋溶效果不明顯。5種形態(tài)中，可交換態(tài)、碳酸鹽結(jié)合態(tài)對環(huán)境條件變化比較敏感，可交換態(tài)在中性環(huán)境中即可釋放出來，而碳酸鹽結(jié)合態(tài)對pH值最敏感，當(dāng)pH值下降時易重新釋放出來，氧化物結(jié)合態(tài)在還原條件下容易溶出，有機結(jié)合態(tài)則在氧化條件下容易釋放出來[18]，由表3還可見，氧化物結(jié)合態(tài)的溶出量與土壤原樣相比，存在顯著差異，而殘渣態(tài)差異不明顯，說明重金屬Cd的溶出是在還原條件下進行的。殘渣態(tài)重金屬存在于礦物晶格中，性質(zhì)穩(wěn)定，在自然條件下不易溶出[19]，因此黑曲霉對殘渣態(tài)Cd的溶出效果較差。

表3 土壤中Cd的形態(tài)分布

3 討論與結(jié)論

(1)黑曲霉分泌的檸檬酸、草酸含量及Cd2+溶出率與CdCO3添加量有關(guān)。隨著CdCO3添加量增加，檸檬酸的累積量減少，草酸的累積量提高，Cd2+溶出率增加。(2)不同土壤添加量對黑曲霉菌體生長、發(fā)酵液pH值以及Cd溶出率有不同的影響，土壤添加量較高時，黑曲霉菌體含量和Cd溶出率下降，土壤添加量為11.68 g的溶出效果最優(yōu)。(3)黑曲霉對土壤重金屬Cd的可交換態(tài)、碳酸鹽結(jié)合態(tài)、氧化物結(jié)合態(tài)溶出效果較為明顯，但對性質(zhì)穩(wěn)定的有機結(jié)合態(tài)、殘渣態(tài)溶出效果不明顯。

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