古倩怡， 周天成， 李袁源， 何 凱， 李洪武， 張利平， 李仕平

(1.海南大學/南海海洋資源利用國家重點實驗室，海南海口 570228； 2.中國科學院大學，北京 100049；3.海口科品生物科技有限公司，海南海口 570208； 4.海南省?？谑兴a技術推廣站，海南海口 570125)

酶制劑可分為單一酶制劑和復合酶制劑，作為一種生物活性物質廣泛應用于畜牧業(yè)、農業(yè)，越來越多的人發(fā)現酶制劑具有發(fā)展?jié)摿?，將其應用于水產動物養(yǎng)殖，取得了良好成效[1-5]。酶制劑不僅能促進營養(yǎng)物質的分解和消化，還能提高餌料利用率，最重要的是酶制劑的加入能夠有效改善水產動物的健康狀態(tài)，可以在一定程度上降低水體中N、P等元素的濃度，加速排泄物中不良消化物的分解，起到凈化水體的作用[6-9]。鹵蟲(Artemiasalina)是一種較為低等的甲殼類動物，主要以水中的浮游藻類和細小碎屑為食，最適溫度22～28 ℃，富含蛋白質和脂肪酸，是水產養(yǎng)殖產品的優(yōu)質活餌料，也是許多水產養(yǎng)殖產品幼體理想的開口餌料，具有廣闊的應用前景[10]。在培養(yǎng)鹵蟲時加入酶制劑，雖然一定程度上提高了經濟成本，但能夠有效地改善鹵蟲生活水體的環(huán)境，提高鹵蟲的免疫能力，而且利用鹵蟲飼養(yǎng)的魚類及其他水產經濟作物的免疫能力和健康情況等也能夠獲得相應的提升，既能抑制抗生素濫用的情況，又能實現生態(tài)效益和經濟效益的最優(yōu)化，形成良性循環(huán)[11-12]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 葡萄糖氧化酶制劑母液的制備 稱取10.00 g葡萄糖氧化酶制劑，溶于少量水中，全量移至100 mL容量瓶，稀釋至標線，混勻后盛于聚乙烯瓶，得100 g/L葡萄糖氧化酶母液，置于冰箱冷藏備用。

1.1.2 復合酶制劑母液的制備 稱取10.00 g復合酶制劑，溶于少量水中，全量移至100 mL容量瓶，稀釋至標線，混勻后盛于聚乙烯瓶，得100 g/L復合酶母液，置于冰箱冷藏備用。

1.1.3 藻類的培養(yǎng) 本試驗飼養(yǎng)鹵蟲投喂的餌料為小球藻，藻類培養(yǎng)液為寧波3號培養(yǎng)液[13]，海水經高溫消毒滅菌。

1.1.4 鹵蟲的培養(yǎng) 利用0.005%高錳酸鉀溶液消毒孵化培養(yǎng)容器，再用滅菌海水沖洗浸泡，然后在孵化培養(yǎng)裝置里加入經高溫滅菌的天然海水。加入適量鹵蟲卵，孵化溫度為 25 ℃，pH值為7～8，自然光照，曝氣24 h，即可得到孵化出的鹵蟲幼體。迅速將鹵蟲幼體轉移至新鮮海水，投喂小球藻[14]。

1.2 試驗方法

在每組試驗中，將2 000 mL天然海水加入3 000 mL燒杯，每個燒杯內投放培養(yǎng)的1日齡鹵蟲幼體密度為 0.2 ind./mL(即每個燒杯內有400頭鹵蟲幼體)。培養(yǎng)溫度為25 ℃，pH值為7～8，自然光照，每天定時投餌，定期清理燒杯底部沉淀并換水，避免影響水質，每次試驗周期為21 d[15]。

1.2.1 不同酶制劑對鹵蟲體長的影響 結合臺微尺計算目微尺每格所代表的實際長度。每次換水時隨機取10頭鹵蟲，用魯戈氏液染色固定后制片，在帶有目微尺的光學生物顯微鏡(北京泰克儀器SA 3000)下測量體長，計算各個時期鹵蟲體長，直至形成性成熟(21日齡)[16]。

1.2.2 不同酶制劑對鹵蟲死亡率的影響 每次換水前停止充氣30 min，待死亡鹵蟲尸體和碎屑沉底后將其吸出，記錄死亡鹵蟲數量，計算鹵蟲的存活率[17]。

1.2.3 不同酶制劑對鹵蟲干質量的影響 每次換水時隨機取10頭鹵蟲，用濾紙吸干并烘干，用分析天平[賽多利斯科學儀器(北京)LA230S型]稱量其質量，計算各個時期鹵蟲的增質量，直至性成熟(21日齡)[18]。

1.3 試驗時間和地點

2016年2月在海南大學海洋學院二樓開展試驗。

2 結果與分析

2.1 不同酶制劑對鹵蟲體長的影響試驗

定期測量鹵蟲體長，直至鹵蟲21日齡，記錄試驗結果，根據鹵蟲體長測量結果繪制體長變化曲線圖(圖1)。與空白組相比，加酶組鹵蟲受酶影響較大，體長大部分有顯著增加，有87.5%鹵蟲的體長有顯著提高，但2.0 g/L復合酶制劑組呈現出對鹵蟲體長的抑制作用；葡萄糖酶制劑組與復合酶制劑組相比，復合酶制劑組的試驗效果較好，1.0 g/L復合酶制劑組試驗效果最佳，對鹵蟲體長促進效果最優(yōu)，0.5 g/L復合酶制劑組試驗效果次之。試驗初期(7日齡前)各組對比不明顯，從試驗中期(7日齡后)開始各試驗組間對比明顯，試驗后期(14日齡后)各組對比顯著，并且1.0 g/L復合酶制劑對鹵蟲體長的促進作用效果最為顯著。

2.2 不同酶制劑對鹵蟲死亡率的影響

定期吸取各組的底部碎屑與死亡鹵蟲尸體，記錄鹵蟲死亡數量，計算鹵蟲存活率并繪制存活率曲線圖(圖2)?？瞻捉M與各加酶組的死亡率走勢大體相同，呈下降趨勢。但各組受影響差異程度較大，有的試驗組效果顯著，極大降低了鹵蟲死亡率；有的試驗組鹵蟲的死亡率提高近1/2。葡萄糖氧化酶制劑組總體表現較優(yōu)，對鹵蟲死亡率均有不同程度的作用，復合酶制劑組雖有2組的死亡率遠高于空白組，但另外2組復合酶制劑的死亡率是各試驗組中最低的，且1.0 g/L復合酶制劑組死亡率低至17.37%，死亡率減少近1/3，效果顯著。

2.3 不同酶制劑對鹵蟲干質量的影響試驗

烘干后稱量鹵蟲的干質量并記錄，根據干質量結果繪制柱形圖(圖3)，對比空白組與各試驗組的21日齡鹵蟲干質量。與空白組相比，加酶組鹵蟲干質量增加顯著，87.5%鹵蟲干質量增長顯著；與空白組對比，各葡萄糖氧化酶制劑組均呈顯著增長，其中1.5 g/L葡萄糖酶制劑組在葡萄糖氧化酶制劑組表現最優(yōu)，干質量達14.9 mg；復合酶制劑組中，1.5 g/L復合酶制劑組表現最優(yōu)，干質量達16.9 mg，但2.0 g/L復合酶制劑組干質量略低于空白組?？傮w而言，葡萄糖氧化酶制劑組整體表現優(yōu)于復合酶制劑組，但復合酶制劑組在一定濃度下提高干質量效果顯著，1.0 g/L復合酶制劑組21日齡鹵蟲質量達16.9 mg。

3 討論與結論

3.1 酶制劑中酶含量對試驗效果的影響

酶具有高效性，在低濃度下能夠發(fā)揮較高的催化效率，實現能量的轉化[19]。酶制劑為粗酶，酶含量較少，制作過程中為了便于運輸和儲存，摻雜了許多成分如糊精等，降低了酶制劑中的有效成分——酶的含量，從而導致試驗用酶制劑濃度偏高[20-21]。研究發(fā)現，酶制劑濃度從10 mg/L開始，鹵蟲體長、干質量和死亡率等均受各組酶制劑的作用產生些許變化，為探究試驗酶制劑最適濃度，在濃度的選擇上也稍高。酶制劑濃度越高，成本越高，但從實際產出的角度出發(fā)，適度地提高酶制劑的濃度，才能夠達到更為理想的生產效果、實現產出的最優(yōu)化。

3.2 酶制劑對鹵蟲的作用機制

酶具有專一性，對特定的底物產生催化作用。復合酶在促進體長、干質量和降低死亡率方面，較葡萄糖氧化酶而言，表現更為理想。復合酶制劑含有蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶等，葡萄糖氧化酶制劑只含有1種酶，即葡萄糖氧化酶。經過觀察發(fā)現，孵化初期的鹵蟲消化道較短小，發(fā)育不夠完善，其體內的消化酶較少，對小球藻的轉化利用率較低，所以早期各組鹵蟲的體長和干質量并無較大差別。自中期開始至試驗結束，鹵蟲在各濃度酶制劑作用下體長、干質量和存活率有顯著差異?？赡苁且驗辂u蟲從中期開始，腸道漸漸發(fā)育完全，小球藻含有大量淀粉、蛋白質和纖維素，復合酶制劑的加入補充解決了多種內源性消化酶分泌不足的問題，而復合酶制劑只能針對性地解決1種，從而最大程度提高營養(yǎng)成分的利用效率，提高復合酶制劑組鹵蟲的體長和干質量[22-24]。2種酶制劑不同程度上都具有提高鹵蟲的免疫力、抗病能力和存活率，實踐應用和科學研究應根據相應的需求選擇對應的酶制劑以獲得理想的效果。

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