盧勁曄， 顧蓓蓓， 馮 晴， 馬 卉， 盧 煒， 劉 靜

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300； 2.泰州出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇泰州 225300； 3.江蘇省東海縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，江蘇東海 222002)

乳腺炎是由多種非特異性的病原微生物引起的，目前臨床上分離的乳腺炎致病菌超過137種，大腸桿菌是臨床型乳腺炎中最常見的類型[1]。病原菌入侵宿主是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)的多因子作用過程。中性粒細(xì)胞(polymorphonuclear neutrophilic leukocytes，PMN)是乳腺抵御病原菌入侵重要的防御細(xì)胞，PMN的活化在炎癥的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸過程中發(fā)揮了重要的作用。研究證實(shí)PMN通過釋放活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)殺滅病原微生物[2-3]。ROS的產(chǎn)生對清除胞內(nèi)微生物是必需的，但持續(xù)過度激活，超過局部抗氧化劑的防御反應(yīng)時(shí)，會(huì)引起乳腺上皮細(xì)胞的死亡、脫落[4-5]。

維生素A是含有β-白芷酮環(huán)的不飽和脂肪醇，是動(dòng)物及人類維持正常生命活動(dòng)所必需的脂溶性維生素，視黃醇、視黃醛和視黃酸是維生素A的3種衍生物，通常所說的維生素A即視黃醇。研究表明，視黃醇對維持上皮細(xì)胞的完整性，促進(jìn)動(dòng)物生長，維持正常的視覺，維持骨骼正常的生長代謝都是必不可少的。近年來，研究發(fā)現(xiàn)，視黃醇能提高機(jī)體免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體抗感染能力[6-7]。本試驗(yàn)將研究視黃醇對大腸桿菌誘發(fā)的試驗(yàn)性乳腺炎大鼠氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)作用，為奶牛乳腺的健康調(diào)控提供一條新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌

乳腺炎致病菌大腸桿菌(Escherichialcoli)由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院泌乳生化教研室提供。大腸桿菌經(jīng)肉湯培養(yǎng)基復(fù)壯后在普通營養(yǎng)瓊脂平板分離成單個(gè)菌落，試驗(yàn)前挑取單個(gè)菌落于肉湯培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h，無菌取100 μL均勻涂抹在瓊脂糖平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h后刮取菌苔，溶解于滅菌磷酸鹽緩沖液(PBS)，3 000 r/min離心10 min，連續(xù)3次，用平板稀釋計(jì)數(shù)法調(diào)整濃度至2×1012CFU/mL。

1.2 動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

60只清潔級(jí)SD大鼠，自懷孕10 d起，每天灌胃 8 000 IU/(kg·d)視黃醇(溶解于大豆油)，對照組灌胃等體積大豆油直至分娩。產(chǎn)后72 h經(jīng)乳頭管注入2×1012CFU/mL 大腸桿菌懸液每側(cè)100 μL到第4對乳腺(兩側(cè))內(nèi)，分別于灌注前(定義為0 h)及灌注后12、24、48、72 h(n=6)頸靜脈放血處死動(dòng)物，收集血清、肝素抗凝血及乳腺組織用于后續(xù)分析。

1.3 主要試劑及儀器

髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)試劑盒，購于南京建成生物工程研究所；TRIzol購自Invitrogen公司；RNA酶抑制劑、隨機(jī)引物、M-MLV、dNTPs購自Promega公司；SYBR? Green PCR Master Mix購自Toyobo公司；乙酸肉豆蔻佛波酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)、雙氫羅丹明(dihydrorhodamin，DHR 123)購自Sigma公司。

UV755B型分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；光學(xué)顯微鏡，日本奧林巴斯BH2；組織勻漿器，瑞士Kinematica AG；核酸濃度測定儀，德國Eppendorf Biophotometer；熒光定量PCR儀，ABI Prism 7300；流式細(xì)胞儀，美國BD Biosciences。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 熒光定量PCR檢測乳腺組織細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)mRNA表達(dá) TRIzol試劑盒提取乳腺組織總RNA，用隨機(jī)引物同時(shí)對所有樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，建立各樣品的cDNA。PCR反應(yīng)條件為： 95 ℃ 1 min；95 ℃ 20 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，45個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCT法。ICAM-1及β-actin基因引物序列見表1。

表1 PCR擴(kuò)增引物參數(shù)

1.4.2 血清與乳腺組織中MPO的測定 按試劑盒說明書操作。

1.4.3 流式細(xì)胞術(shù)測定外周血PMN活性氧釋放 100 μL全血加入終濃度為100 ng/mL PMA刺激PMN，同時(shí)設(shè)無PMA刺激對照(等量PBS代替PMA)；37 ℃ 15 min后加入DHR123工作液，終濃度為5 μmol/L，37 ℃孵育10 min；裂解紅細(xì)胞，0.01 mol/L、pH值7.2 PBS洗滌2次并重懸于PBS中，混勻后流式細(xì)胞儀檢測。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 17.0方差分析程序?qū)υ囼?yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳腺組織ICAM-1 mRNA相對表達(dá)的變化

誘發(fā)試驗(yàn)性乳腺炎后乳腺組織ICAM-1 mRNA相對表達(dá)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著升高，72 h時(shí)表達(dá)有下降趨勢，但仍顯著高于0 h。對照組ICAM-1相對表達(dá)峰值出現(xiàn)在24 h時(shí)，試驗(yàn)組ICAM-1相對表達(dá)峰值前提，出現(xiàn)在12 h時(shí)，且峰值較對照組高，48、72 h時(shí)相對表達(dá)仍高于0 h，但與同時(shí)間點(diǎn)的對照組相比已有所下降(圖1)。

2.2 血清與乳腺組織中MPO活性的變化

誘導(dǎo)乳腺炎后12 h，對照組血清中MPO活性顯著升高，試驗(yàn)組與同時(shí)間點(diǎn)對照組相比MPO活性顯著降低(圖2-A)。乳腺組織中MPO活性12、24 h與0 h差異顯著，峰值出現(xiàn)在24 h，至72 h時(shí)基本恢復(fù)至正常水平。與同時(shí)間點(diǎn)比較，試驗(yàn)組MPO活性均低于對照組，且12、24 h差異顯著(圖2-B)。

2.3 外周血中性粒細(xì)胞活性氧釋放的動(dòng)態(tài)變化

從圖3可以看出，灌注大腸桿菌懸液后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)外周血PMN活性氧釋放與0 h比較均顯著升高，峰值出現(xiàn)在 24 h。與對照組相比，視黃醇處理能顯著刺激誘導(dǎo)后12 h PMN活性氧的釋放，隨后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)試驗(yàn)組ROS釋放均顯著低于同時(shí)間點(diǎn)的對照組。

3 討論與結(jié)論

作為機(jī)體最大的外分泌腺，乳腺在進(jìn)化、發(fā)育和泌乳再構(gòu)建的過程中時(shí)刻面臨著病原微生物的侵襲。病原菌入侵乳腺組織是一個(gè)復(fù)雜動(dòng)態(tài)的多因子作用過程，然而目前宿主對抗乳腺感染的作用機(jī)制研究尚不深入，這是乳腺炎得不到有效控制的原因之一。

PMN是機(jī)體抵抗感染的主要非特異性防御細(xì)胞，病原菌入侵乳腺組織后大量循環(huán)血液中的PMN向乳腺組織遷徙，是乳腺炎發(fā)生時(shí)的重要特征。細(xì)菌入侵后通過激活NF-κB/AP-1刺激單核、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生多種趨化因子促進(jìn)PMN的趨化[8-9]。ICAM-1屬于免疫球蛋白超家族的成員，廣泛表達(dá)于各種細(xì)胞表面，在細(xì)胞間的相互作用以及白細(xì)胞黏附聚集中起著重要作用[10]。本研究顯示，在大腸桿菌誘發(fā)的大鼠試驗(yàn)性乳腺炎模型中，乳腺組織中ICAM-1 mRNA表達(dá)顯著升高，但是與對照組相比，視黃醇能提前啟動(dòng)ICAM-1的高表達(dá)，促進(jìn)PMN迅速遷徙至炎癥部位發(fā)揮吞噬活性。

MPO是PMN的標(biāo)志酶，MPO活性的高低反映了PMN在組織中的潴留和活化程度。灌注大腸桿菌懸液后乳腺組織中MPO活性迅速上升，視黃醇處理能顯著下調(diào)MPO活性，表明視黃醇能緩解PMN在乳腺組織持續(xù)過度激活引起的組織損傷。PMN進(jìn)入宿主乳腺組織，主要是通過釋放ROS吞噬病原微生物，ROS是宿主抵御感染的主要效應(yīng)分子，但是ROS的產(chǎn)生在殺滅病原微生物的同時(shí)，對宿主細(xì)胞和吞噬細(xì)胞本身也會(huì)造成損傷[4-5]。ROS的結(jié)果與MPO活性變化規(guī)律一致，大腸桿菌灌注乳腺后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)ROS均顯著升高，視黃醇能提前刺激PMN釋放ROS發(fā)揮吞噬活性，減輕PMN持續(xù)激活引起的組織損傷。

大量循環(huán)血液中的PMN在病原微生物或其他活性分子的作用下向乳腺組織遷徙是乳腺炎發(fā)生時(shí)的重要特征。PMN通過釋放活性氧消滅病原微生物，但高毒性的活性氧也會(huì)引起乳腺組織的損傷。研究表明，視黃醇處理能促使機(jī)體迅速啟動(dòng)免疫反應(yīng)，促進(jìn)PMN等效應(yīng)細(xì)胞第一時(shí)間遷徙至乳腺組織發(fā)揮吞噬效應(yīng)，同時(shí)大量被激活的PMN能迅速從乳腺腺泡清除促進(jìn)了乳腺炎癥的轉(zhuǎn)歸。研究結(jié)果為臨床上乳腺炎的免疫調(diào)控及防治提供了理論基礎(chǔ)。

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