易恒潔， 李 輝， 趙忠海， 楊華婷， 石 璇， 王成棟，3

(1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院/高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州貴陽 550025；2.貴州省正安縣畜牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展辦公室，貴州遵義 563400； 3.貴州省畢節(jié)市農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)辦公室，貴州畢節(jié) 551700)

單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)具有感受細(xì)胞能量代謝變化的功能，其α亞基存在磷酸激酶活性調(diào)控區(qū)，參與某些糖的磷酸化過程，能夠調(diào)節(jié)機體細(xì)胞單糖、揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acid，VFA)等供能物質(zhì)的代謝過程[1-3]。在真核細(xì)胞動物中，AMPK家族基因包含了不同的亞基基因，它包括PRKAA1、PRKAA2、PRKB1、PRKAB2、PRKAG1、PRKAG2和PRKAG3等7個基因。Lee等研究表明，AMPK信號通路的基因已被證實能夠改變細(xì)胞的代謝并在惡性腫瘤發(fā)生過程中起著重要的作用[4]，因此，PRKAA1基因可作為大腸癌患者手術(shù)切除后的預(yù)后標(biāo)志。Yuan等研究顯示，PRKAA1基因在免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，人的該基因多態(tài)性可能使其更易感染慢性乙型肝炎病毒[5]。研究表明，PRKAA1基因?qū)儆诰幋a蛋白基因，能夠在骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝臟細(xì)胞中表達(dá)。孫成娟等報道，PRKAA1基因在貴州香豬肺臟纖維細(xì)胞中的表達(dá)量極顯著高于其他細(xì)胞，而在背最長肌中的表達(dá)量最低[6]。Kim等對477例韓國人群PRKAA1基因5個異突變位點進(jìn)行假設(shè)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PRKAA1基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)與患胃癌風(fēng)險呈正相關(guān)[7]。目前，對于PRKAA1基因的研究主要集中于人類疾病以及一些模式生物上，對于畜禽的研究報道較為鮮見，高坡豬是貴州優(yōu)良地方品種，具有肉品質(zhì)好、抗逆性強、耐粗飼等特點[8]，但由于近年來外來品種的引進(jìn)，加之農(nóng)戶采用粗放型飼養(yǎng)方式養(yǎng)殖，人為因素過強地干預(yù)選育，高坡豬品種資源岌岌可危，本研究以高坡豬為研究對象，以期尋找有效的分子遺傳標(biāo)記，為該品種進(jìn)一步的開發(fā)利用、保種等提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗以高坡豬為研究對象，試驗用動物由貴州自然之園生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展股份有限公司高坡豬養(yǎng)殖場提供，隨機抽取10月齡的50頭高坡豬進(jìn)行屠宰，采集背最長肌置于冰盒帶回實驗室，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA提取

試驗采用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，分別對50頭高坡豬背最長肌中基因組DNA抽提，并用微量紫外分光光度計對所獲得的DNA進(jìn)行濃度和純度測定，1.0%瓊脂糖凝膠檢測其完整性。

1.3 引物設(shè)計及PCR擴增

根據(jù)GenBank發(fā)布家豬PRKAA1基因序列，利用引物設(shè)計軟件Primer 5.0對豬PRKAA1基因設(shè)計8對特異性引物進(jìn)行全部外顯子擴增，引物由上海英駿科技有限公司合成。PCR擴增反應(yīng)采用30 μL體系，具體操作如下：上游引物 2 μL，下游引物2 μL，DNA模板3 μL，2×TaqPCR Master Mix(北京天根生化科技有限公司)14 μL，雙蒸水9 μL；95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性40 s，退火35 s，72 ℃延伸40 s，72 ℃終延伸10 min，32循環(huán)。基因擴增引物詳細(xì)信息見表1。

1.4 肉質(zhì)測定

參照GB/T 5009.3—2003《食品中水分的測定》，用直接干燥法測定肌肉水分含量；參照GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白質(zhì)的測定》，用微量凱氏定氮法測定粗蛋白質(zhì)含量；參照GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測定》，用索氏抽提法測定粗脂肪含量；參照GB/T 5009.4—2003《食品中灰分的測定》，用灼燒稱質(zhì)量法測定粗灰分含量。

表1 高坡豬PRKAA1基因擴增引物詳細(xì)信息

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2007對數(shù)據(jù)進(jìn)行分類統(tǒng)計，DNAstar進(jìn)行序列分析、比對，調(diào)用SPSS 18.0中的GLM模型對不同基因型與肉質(zhì)性狀間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR產(chǎn)物檢測

以高坡豬基因組DNA為模板，分別對8對引物進(jìn)行PCR擴增，產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)目的條帶與預(yù)期結(jié)果一致，且引物特異性良好，PCR產(chǎn)物無需純化可直接用于測序(圖1)。

2.2 PCR產(chǎn)物測序及序列分析

根據(jù)目的片段擴增結(jié)果，將PCR產(chǎn)物全部送往北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行雙向測序。測序結(jié)果經(jīng)DNAstar拼接并與GenBank發(fā)布的豬PRKAA1基因序列進(jìn)行校正、比對，結(jié)果在試驗群體的PRKAA1基因中發(fā)現(xiàn)存在3個SNPs(圖2)，分別為g.12988 T

2.3 高坡豬PRKAA1基因遺傳特性分析

測序結(jié)果經(jīng)序列對比發(fā)現(xiàn)，在試驗群體的PRKAA1基因中找到了3個SNPs，根據(jù)3個SNPs對應(yīng)的突變位置將它們分別對應(yīng)的純合子和雜合子命名為TT、TC，AA、AG、GG和AA、AG、GG基因型。根據(jù)表2統(tǒng)計的結(jié)果，g.12988 T0.05)；除了g.12988 T

表2 高坡豬PRKAA1基因多態(tài)位點基因型頻率及等位基因頻率

2.4 PRKAA1基因與肉質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)分析

根據(jù)SNPs分型的結(jié)果，對不同基因型與肉質(zhì)間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行分析，由于g.12988 T

表3 PRKAA1基因多態(tài)位點與肉質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)分析

注：同行數(shù)據(jù)后標(biāo)有不同小寫、大寫字母分別表示基因型差異顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)。

3 討論與結(jié)論

對于養(yǎng)殖戶或者育種家來說，在追求動物快速增長的同時更加注重肉品質(zhì)的質(zhì)量。目前從人們的消費習(xí)慣來看，消費者更加注重肉質(zhì)的風(fēng)味，而影響肉質(zhì)風(fēng)味的重要指標(biāo)之一則是肌內(nèi)脂肪的沉積程度。有研究結(jié)果表明，PRKAA1基因?qū)?nèi)脂肪的沉積起到一定的調(diào)控作用[9]，與骨骼肌的形成和肌纖維的類型也有著密切的聯(lián)系[10]。Zhong等研究結(jié)果表明，PRKKA1和PRKAA2基因可介導(dǎo)磷酸化乙酰輔酶A的活性，從而使機體適應(yīng)高應(yīng)激環(huán)境，當(dāng)動物處于環(huán)境壓力較高、體內(nèi)酶活性降低的時候，PRKK1和PRKAA2基因可同時介導(dǎo)使胚胎干細(xì)胞分化增加，彌補干細(xì)胞的數(shù)量不足，以提高動物的繁殖能力[11]。Kim等認(rèn)為，PRKAA1基因的5個SNPs位點與胃癌的發(fā)生相關(guān)[7]。目前，關(guān)于PRKKA1基因的相關(guān)研究報道較少，在豬上的研究更少，孫成娟等對貴州從江香豬PRKAA1基因mRNA表達(dá)在組織中的表達(dá)情況進(jìn)行探究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在其試驗所涉及的組織中均能檢測到表達(dá)，說明該基因?qū)儆趶V譜表達(dá)基因[6]。田萬強研究指出，PRKAA1基因第7外顯子上的213T/A多態(tài)位點與秦川牛肌內(nèi)脂肪含量極顯著關(guān)聯(lián)(P<0.01)[12]。本研究以高坡豬PRKAA1基因為研究對象，對該基因進(jìn)行PCR擴增，序列對比發(fā)現(xiàn)在g.12988 T

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