張 聞， 鄭立穩(wěn)， 王加寧， 黃玉杰， 張思玉， 高永超， 陳貫虹， 郭書(shū)海，， 季 蕾， 王磊磊

[1.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)/山東省科學(xué)院生態(tài)研究所/山東省應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250103；2.中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所，遼寧沈陽(yáng) 110164]

多環(huán)芳烴是環(huán)境中廣泛存在的一類典型持久性有機(jī)污染物，污染范圍大、涉及面廣，并呈現(xiàn)加重的趨勢(shì)[1-2]，治理多環(huán)芳烴污染迫在眉睫。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)多環(huán)芳烴污染修復(fù)技術(shù)開(kāi)展了大量研究，主要有物理、化學(xué)、生物修復(fù)[3-6]，其中生物修復(fù)因具有成本低、無(wú)二次污染、可大面積應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn)而受到重視。生物強(qiáng)化法是生物修復(fù)的重要手段之一，其主體是人為投加有高效降解能力的降解菌或菌群，這些微生物可以通過(guò)從土著菌中篩選馴化獲得、對(duì)土著菌進(jìn)行物理化學(xué)誘變后篩選獲得、通過(guò)基因工程構(gòu)建獲得，降解菌的濃度可控，降解能力強(qiáng)。外源降解菌進(jìn)入污染環(huán)境后，會(huì)受污染物脅迫，并與土著菌競(jìng)爭(zhēng)，其存活和增殖情況在整個(gè)修復(fù)期內(nèi)呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化。外源降解菌的豐度與分布直接關(guān)系著修復(fù)效果。對(duì)降解菌進(jìn)行實(shí)時(shí)定量追蹤，可準(zhǔn)確了解其進(jìn)入土壤后的存活、增殖情況，從而為改進(jìn)修復(fù)時(shí)菌劑的投加量和投加方式提供理論指導(dǎo)，因此有必要開(kāi)發(fā)出特定外源降解菌在土壤中數(shù)量的檢測(cè)方法。

傳統(tǒng)的微生物數(shù)量檢測(cè)方法有稀釋平板法、血球計(jì)數(shù)板法等，但這些方法只能對(duì)樣品中的全部微生物進(jìn)行無(wú)差別的計(jì)數(shù)，無(wú)法對(duì)樣品中的微生物進(jìn)行準(zhǔn)確的種屬區(qū)分，因此無(wú)法排除環(huán)境樣品中土著微生物的干擾對(duì)特定菌株進(jìn)行數(shù)量檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)[7-10]可以準(zhǔn)確定量特定類群微生物的數(shù)量，具有靈敏度高、精確性好、特異性強(qiáng)、安全快速等優(yōu)點(diǎn)[11-13]，已被應(yīng)用于檢測(cè)環(huán)境樣品中的目標(biāo)微生物。目前，基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)有機(jī)污染土壤及其他環(huán)境樣品中微生物的定量方法多以16S/18S rDNA、ITS或功能基因?yàn)槟康幕騕14-15]，研究多集中于某類或某幾類土著降解菌，缺少對(duì)某種特定外源降解菌進(jìn)入環(huán)境后數(shù)量、分布情況的關(guān)注。本研究針對(duì)外源多環(huán)芳烴降解菌，篩選出其特異性基因序列及特異引物，構(gòu)建實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系，將其應(yīng)用于污染土壤中外源降解菌的檢測(cè)，并驗(yàn)證其可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

多環(huán)芳烴降解菌假單胞菌(Psedomonassp.)PPZ-1菌株分離自多環(huán)芳烴污染土壤，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏號(hào)為CGMCC No. 12596。將菌株送至北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行基因組框架圖測(cè)序，得到編碼基因預(yù)測(cè)結(jié)果。

1.2 試驗(yàn)土壤

土壤樣品分別采自山東濟(jì)南(36°42′29″N，117°04′40″E)、浙江永康(29°00′17″N，120°14′36″E)地區(qū)的農(nóng)田，采樣時(shí)間為2017年1月。2種土壤樣品質(zhì)地分別為壤土、沙壤土，分別命名為土1、土2。土壤樣品的部分理化性質(zhì)如下：pH值分別為8.25、5.57；有機(jī)質(zhì)含量分別為5.2%、3.1%；陽(yáng)離子交換量分別為22.6、11.8 cmol/kg；全氮含量分別為2.28、2.05 g/kg；全磷含量分別為0.96、0.42 g/kg；全鉀含量分別為13、16 g/kg。檢測(cè)土壤中多環(huán)芳烴模式化合物菲的本底含量分別為194、748 μg/kg，向土壤中加入菲使其濃度為 100 mg/kg，老化2周，以刺激土著降解菌的生長(zhǎng)。

1.3 主要試劑

LB培養(yǎng)基，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；TaqDNA聚合酶、10×PCR buffer(無(wú)Mg2+，100 mmol/L Tris-HCl，pH值為8.8，25 ℃，500 mmol/L KCl，0.8%乙基苯基聚乙二醇)、MgCl2(25 mmol/L)、dNTP(10 mmol/L)、Marker、6×DNA Loading Dye、10×TAE(400 mmol/L Tris-acetate，10 mmol/L EDTA，pH值為8.0)、引物、細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒(B518225)、土壤基因組DNA抽提試劑盒(B618763)、4S Red Plus核酸染色劑(BBI A606695)、瓊脂糖-柱式DNA膠回收試劑盒(SK8131)、一步法快速感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒(SK9307)、SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒(SK8191)，均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；pMD? 18-T Vector，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.4 主要儀器

HC-2518R高速冷凍離心機(jī)，購(gòu)自安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；DYY-6C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，購(gòu)自北京六一生物科技有限公司；FR980凝膠成像系統(tǒng)，購(gòu)自上海復(fù)日科技有限公司；TU-1901紫外分光光度計(jì)，購(gòu)自北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀，購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；3730XL測(cè)序儀，購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；StepOne型熒光定量PCR儀，購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.5 DNA提取

使用細(xì)菌及土壤基因組DNA抽提試劑盒，分別提取菌株P(guān)PZ-1、土壤樣品的DNA。提取結(jié)果經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢查，電泳條件為1×TAE，150 V，100 mA，20 min。通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)分析試驗(yàn)結(jié)果，于微量分光光度計(jì)下檢測(cè)DNA濃度及D260 nm/D280 nm，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 特異性基因序列的篩選與引物設(shè)計(jì)

根據(jù)菌株P(guān)PZ-1基因組測(cè)序結(jié)果，將編碼基因分別在通用功能數(shù)據(jù)庫(kù)基因本體(gene ontology，簡(jiǎn)稱GO)、京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，簡(jiǎn)稱KEGG)、直系同源序列聚類分析(cluster of orthologous groups of proteins，簡(jiǎn)稱COG)、非冗余蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)(non-redundant protein database，簡(jiǎn)稱NR)、蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫(kù)(protein family database，簡(jiǎn)稱Pfam)、Swiss-Prot蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)(Swiss-Prot protein sequence database，簡(jiǎn)稱Swiss-Prot)等中進(jìn)行Blast比對(duì)，篩選未注釋到的基因序列，這些序列即為該菌株可能的特異性基因序列。針對(duì)得到的基因序列，使用PrimerPremier 5.0分別設(shè)計(jì)引物。

1.7 PCR擴(kuò)增及電泳

PCR擴(kuò)增體系為25 μL：0.5 μL模板DNA，0.5 μL引物F(10 μmol/L)，0.5 μL引物R(10 μmol/L)，0.5 μL dNTP(10 mmol/L)，2.5 μLTaqbuffer(10×)，2.0 μL MgCl2(25 mmol/L)，0.2 μLTaq酶(5 U/μL)，18.3 μL ddH2O。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃修復(fù)延伸8 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢查，電泳條件同“1.5”節(jié)。通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)分析試驗(yàn)結(jié)果，選擇菌株擴(kuò)增成功，而土壤樣品擴(kuò)增失敗的基因序列及相應(yīng)引物作為后續(xù)目標(biāo)序列及特異性引物，確定特異性序列，切膠回收，克隆測(cè)序。

1.8 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

將目的條帶用手術(shù)刀切下，用試劑盒回收，與T載體連接，轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，涂布于氨芐青霉素抗性平板，置于37 ℃環(huán)境中培養(yǎng)24 h，挑選單克隆于液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，提取質(zhì)粒；以質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得陽(yáng)性目標(biāo)質(zhì)粒。質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序鑒定無(wú)誤后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒的D260 nm，換算成拷貝數(shù)。

1.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線、反應(yīng)體系及條件

10倍梯度稀釋構(gòu)建好的質(zhì)粒，90 μL稀釋液+10 μL質(zhì)粒。實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增體系為20 μL：10 μL 2×SybrGreen qPCR Master Mix，0.4 μL 10 μmol/L引物F，0.4 μL 10 μmol/L引物R，7.2 μL ddH2O，2 μL DNA模板。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，57 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，45個(gè)循環(huán)。

1.10 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法的應(yīng)用可行性

向2種土壤樣品中分別投加活化后的PPZ-1菌液并混合均勻，使其投加量分別為2.0×109、2.0×107、2.0×105、2.0×103CFU/g，分別標(biāo)為1、2、3、4，同時(shí)設(shè)不加菌液的土壤樣品作為對(duì)照，記作CK。提取土壤樣品的DNA，將其稀釋適當(dāng)倍數(shù)上機(jī)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株特異性基因序列與引物

根據(jù)菌株P(guān)PZ-1的基因組測(cè)序結(jié)果，所篩選的未注釋到的基因序列如下，這些序列即為該菌株可能的特異性基因序列：(1)ATGAGCCACCTCTCCGCCGCCCAGATAAATTCCAT-GGTGGATATAGAATCGGCGCGGACTGATCAAATGCGCACCG-ACGGGTATGCTGTCTGCGGACCTCTCGATATCGACCAGCTTC-AACGGGACATCCACCATGCGCCCAGGCAGATTGCTGCCGTA-ACGGGCTGCGGAACACAGATGACGTTCCGGCAGCGGCACAC-TCAAGCGGTAGAAAACGCTCGTCGTTAA；(2)ATGTTCTCCC-ATGAGTCTCGCAGGCCCCGTGCCGGGTGGGTAGTGACGGTTC-ACCTCTGGTGGCAGATGCGTGGAATGTTGGACCAAGTGGCG-CACTTCCACTTGGAAAAATTCATCAGCGCAGGTTTGCGCGGG-TTTTTCTCGGGGGCGGGAGGTGTTGCTGTTCAGGCAGCGTGT-TTGTTCGGCGCGAACTTGCAGTTCGGTAATTTTGAGGGGGTA-ATGCTTCCTGCTAATCAGTTCGTTGTACCCTGCATCGTTGCCT-TGATAGAGTTCAGTGAACGCAAGGGCAATAGGCCCCGCACA-ATGGTTGGCCACTTTCCCTACCCCGTCAGTGTCTAG；(3)ATG-CTGCCCGGGCCCGTGCTGGGCGTAGACGCGGTCGCGGTGTTT-GAGGTTTACGTGCAGCTTTGCCTTTTTCCGAGTAGGCCAGGC-ACTGCCGCAGATCTTGCAAACATGAGCTACAAGCTCTTCGGC-CATGGTTGCCTCCAGGGTGGCGGGTTATGGGCAGCAGAATTG-GCCGCCGCAGTAAAAGCGGCCGTCGCCGTCATGGTTAGGGA-GGCCGTATTTATTTCCGCAACCGCAGCAAGCAACCTCGCGCA-GCCCTTCGATAAGCTCGGCTCCGCAAGCAGGACAGTTGCCTT-CGTTCTCGGTGACTTCCTGTTTGCCAACCAGCTCACCGCAGG-ATGA；(4)ATGCAGTTTGATTTTCTAAAGATGCTTTCGCTATA-TACCCCTGAGCAGCGTGAAAGATGGCCAAATGATATGTCGC-AATGCTTCGGTACTTGTTTCATCGTTATGTGGCTCATCAATGT-TTTGATTAAACATTTCAAACTGAGCCTGCGGCCCTATATGAAT-GGAGCTACTGAGGTTGGTATGGCGGTGGGCAATGAGAAGCGG-CGGAAGGAGAACCTGCCCGCGATATAG。

針對(duì)以上基因序列分別設(shè)計(jì)引物，引物核苷酸序列見(jiàn)表1。

表1 引物核苷酸序列

分別利用上述引物對(duì)假單胞菌PPZ-1、土1-CK、土2-CK的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。由圖1可知，4對(duì)引物均能成功擴(kuò)增菌株DNA。第1、第3、第4對(duì)引物在土壤樣品DNA相同位置均有模糊條帶存在，說(shuō)明其對(duì)土壤樣品DNA擴(kuò)增出了相同大小的基因片斷，其特異性不足以排除土壤背景DNA的干擾。第2對(duì)引物在土壤樣品相同位置無(wú)明顯條帶，特異性較好。土壤性質(zhì)在一定程度上決定了土著微生物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性。土1與土2性質(zhì)差異明顯，它們質(zhì)地不同，分屬壤土和砂壤土；pH值不同，分屬堿性土和酸性土；有機(jī)質(zhì)含量、營(yíng)養(yǎng)元素等也有所不同，因此所孕育的微生物種群會(huì)存在差異。土1-CK、土2-CK中有豐富的DNA片斷，以其DNA擴(kuò)增產(chǎn)物與菌株P(guān)PZ-1進(jìn)行比對(duì)，可有效篩選出菌株P(guān)PZ-1的特異性引物。對(duì)第2對(duì)引物在NCBI上通過(guò)Blast特異性檢驗(yàn)，無(wú)顯著匹配結(jié)果，表明該組引物在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中也是特異的。因此，將第2對(duì)引物及其所對(duì)應(yīng)的基因序列確定為菌株P(guān)PZ-1的特異性引物及特異性基因序列，據(jù)此構(gòu)建實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系

構(gòu)建好的質(zhì)粒濃度為106.02 ng/μL，換算成拷貝數(shù)為 3.46×1010copies/μL。標(biāo)準(zhǔn)曲線最高拷貝數(shù)為1.73×108copies/μL。梯度稀釋樣品擴(kuò)增曲線如圖2所示，每個(gè)稀釋度有3個(gè)平行，從左到右標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為1.73×108、1.73×107、1.73×106、1.73×105、1.73×104、1.73×103copies/μL。曲線較光滑，為典型的“S”形曲線，各循環(huán)閾值(cycle threshold，簡(jiǎn)稱CT值)間隔均勻。

梯度稀釋樣品熔解曲線如圖3所示，曲線峰值單一，峰值出現(xiàn)在84.73 ℃，表明擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物特異性良好且無(wú)引物二聚體影響。

標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果如圖4所示，縱坐標(biāo)是CT值，橫坐標(biāo)是 lg(拷貝數(shù)/μL)，斜率為-3.365，擴(kuò)增效率E=(10-1/斜率-1)×100%=(10-1/-3.365-1)×100%=98.233%，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9，截距為37.624。

綜合上述引物檢測(cè)、擴(kuò)增曲線、熔解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果，可以確定建立的菌株P(guān)PZ-1實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系及反應(yīng)條件合理可靠。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法的應(yīng)用可行性

已有學(xué)者采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)環(huán)境樣品中的有機(jī)污染物降解菌。Tay等利用特異性16S rDNA引物擴(kuò)增2種甲苯降解菌(自養(yǎng)黃色桿菌、分枝桿菌)，構(gòu)建實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)污染水中的目標(biāo)菌數(shù)量[16]。王金玉等以功能酶基因鄰苯二酚1，2雙加氧酶的基因序列為目標(biāo)序列，構(gòu)建實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，定量檢測(cè)苯胺降解菌在苯胺廢水生物強(qiáng)化序批式活性污泥系統(tǒng)中的豐度變化[17]。目前，尚未見(jiàn)嚴(yán)格區(qū)分土著降解菌和外源降解菌的研究。對(duì)土壤中的外源降解菌進(jìn)行絕對(duì)定量的關(guān)鍵，在于找到該菌株與土著降解菌、土著同種屬菌具有差異的特異性基因序列設(shè)計(jì)引物，排除土著菌的干擾，同時(shí)還要保證其擴(kuò)增結(jié)果的準(zhǔn)確性。

由表2可知，本試驗(yàn)的定量檢測(cè)方法所檢測(cè)出的2種土壤中多環(huán)芳烴降解菌PPZ-1的數(shù)量與理論投加量的數(shù)量級(jí)相同，且對(duì)照土壤中檢測(cè)不到該菌存在，說(shuō)明該檢測(cè)方法能夠有效排除土著菌的干擾，準(zhǔn)確、特異地檢測(cè)出土壤中菌株 PPZ-1 的數(shù)量，從而可以為改進(jìn)修復(fù)時(shí)菌劑的投加量和投加方式提供理論指導(dǎo)。

表2 土壤中PPZ-1菌株的數(shù)量

注：ND表示未檢測(cè)到。

3 結(jié)論

本研究針對(duì)外源多環(huán)芳烴降解菌PPZ-1，基于基因組測(cè)序結(jié)果，篩選出了適于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的特異性基因序列和引物。所篩選的特異性引物在菌株中可以擴(kuò)增出條帶，在土壤樣品相同位置無(wú)明顯條帶，具有較好的特異性。

以含有特異性基因序列的重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品，確定實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)試驗(yàn)條件，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為0.999 9，斜率為-3.365，擴(kuò)增效率為98.233%，熔點(diǎn)曲線無(wú)雜峰。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系及反應(yīng)條件合理可靠。

將該檢測(cè)方法應(yīng)用于投加了PPZ-1菌株的多環(huán)芳烴污染土壤，驗(yàn)證其可行性。對(duì)污染土壤中的菌株P(guān)PZ-1進(jìn)行絕對(duì)定量檢測(cè)，檢測(cè)值與理論值數(shù)量級(jí)相同，說(shuō)明該檢測(cè)方法能夠有效排除土著降解菌、土著同種屬菌以及其他土著菌的干擾，準(zhǔn)確、特異地檢測(cè)出土壤中菌株P(guān)PZ-1的數(shù)量，從而可以為改進(jìn)修復(fù)時(shí)菌劑的投加量和投加方式提供理論指導(dǎo)。

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