劉志國(guó)，王冰源，牟玉蓮，魏泓，陳俊海，李奎

?

分子編寫育種——?jiǎng)游镉N的發(fā)展方向

劉志國(guó)1，王冰源1，牟玉蓮1，魏泓2，陳俊海3，李奎1

（1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193，2陸軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物教研室，重慶 400038，3深圳市金新農(nóng)科技股份有限公司，廣東深圳 518106)

隨著基因組學(xué)、基因組編輯技術(shù)的迅速發(fā)展以及顯微注射技術(shù)、體細(xì)胞克隆技術(shù)的廣泛應(yīng)用，一套新型的育種策略和方法已經(jīng)逐漸形成。這一套新型育種策略和方法可以稱為分子編寫育種（breeding by molecular writing, BMW）。該方法可以高效創(chuàng)制新的遺傳標(biāo)記并對(duì)其進(jìn)行快速驗(yàn)證，也可以對(duì)基因組進(jìn)行精確到分子水平的編寫并定向培養(yǎng)新品種，不僅能打破生殖隔離，跨物種的引入新的性狀，更可以對(duì)物種內(nèi)個(gè)體間基因組進(jìn)行精確到單個(gè)堿基的插入、刪除和替換。如外源基因的精確整合，內(nèi)源基因的精確刪除、替換，SNP位點(diǎn)的復(fù)制、刪除或替換等。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是：可以在極大的降低非預(yù)期效應(yīng)的同時(shí)，快速高效的將多種有益性狀聚合到同一品種內(nèi)。分子編寫可進(jìn)行以下四方面工作：（1）新型育種標(biāo)記的創(chuàng)制及驗(yàn)證；（2）跨物種分子編寫；（3）基因組中堿基序列的刪除；（4）物種內(nèi)分子編寫。該育種技術(shù)可以不通過(guò)有性雜交，只引入一個(gè)或幾個(gè)目標(biāo)基因或SNP，快速獲得目標(biāo)性狀突出的遺傳穩(wěn)定新種質(zhì)，然后結(jié)合常規(guī)育種方法育成新品種。該方法將實(shí)現(xiàn)真正的個(gè)體和群體水平的基因（或分子）雜交育種，獲得分子雜種優(yōu)勢(shì)，能夠高效的解決長(zhǎng)久以來(lái)困擾育種工作的諸多難題，大大提高育種效率，尤其在畜禽育種中具有重要應(yīng)用前景，將會(huì)是未來(lái)育種的發(fā)展方向。文章詳細(xì)論述了分子編寫育種技術(shù)的基本概念、研究手段、研究?jī)?nèi)容、研究現(xiàn)狀并展望了該技術(shù)的應(yīng)用前景，為動(dòng)物育種、畜禽繁殖等領(lǐng)域的研究及從業(yè)人員提供了參考。

育種；分子編寫；基因編輯；體細(xì)胞核移植；基因敲除

隨著基因組編輯技術(shù)，尤其是規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列/規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列關(guān)聯(lián)蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins，CRISPR/Cas）[1-2]技術(shù)的出現(xiàn)和廣泛應(yīng)用，利用基因編輯技術(shù)對(duì)基因組進(jìn)行精確修飾，并通過(guò)顯微注射技術(shù)、體細(xì)胞克隆技術(shù)、胚胎移植技術(shù)獲得基因編輯動(dòng)物個(gè)體或群體已經(jīng)越來(lái)越普遍[3]。這一方法不僅在基因功能研究、疾病模型動(dòng)物制備等方面有著重要的應(yīng)用意義，更在畜禽動(dòng)物新品種培育方面具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，市場(chǎng)前景十分廣闊。利用基因組編輯技術(shù)進(jìn)行育種，需要一系列與傳統(tǒng)育種以及轉(zhuǎn)基因育種既有聯(lián)系又有區(qū)別的新理念、新策略和新方法，筆者將這一套策略和方法稱之為分子編寫育種（breeding by molecular writing, BMW），這一育種方法具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和市場(chǎng)前景，利用好這一套新的育種方法不僅有助于快速培育畜禽動(dòng)物新品種，而且會(huì)改變現(xiàn)有的育種方式，并將對(duì)世界范圍內(nèi)的畜禽養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生重要的影響。

本文將詳細(xì)論述常規(guī)動(dòng)物育種技術(shù)的現(xiàn)狀和難點(diǎn)以及分子編寫育種方法的基本概念、研究手段、研究?jī)?nèi)容、研究現(xiàn)狀并展望其發(fā)展前景和對(duì)育種工作的影響，為動(dòng)物育種、畜禽養(yǎng)殖以及相關(guān)政策制定提供參考。

1 動(dòng)物育種的現(xiàn)狀與難點(diǎn)

培育動(dòng)物新品種的主要方式是雜交育種和選擇育種。以豬的育種為例，所有的現(xiàn)代種豬幾乎都是通過(guò)不同品種的豬雜交并長(zhǎng)期選育而成的[4]?！队?guó)大百科全書》記載“現(xiàn)在歐洲的豬種，是當(dāng)?shù)刎i種與中國(guó)豬雜交而成”。比如著名的約克夏豬（Yorkshire）和巴克夏豬（Berkshire）都是將廣東豬種和英國(guó)當(dāng)?shù)刎i種雜交，并經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期選育而形成的。美國(guó)的切斯特白豬（Chester White）、波中豬（Poland China）則是在1817年引進(jìn)華南豬雜交改良并長(zhǎng)期選育而成。

雜交育種為動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展做出了巨大的貢獻(xiàn)。中國(guó)從20世紀(jì)50年代開始，開展了廣泛的“土洋”豬雜交育種。通過(guò)地方品種與引進(jìn)品種的雜交，把引進(jìn)品種的瘦肉率高、日增重快、飼料轉(zhuǎn)化率好的特點(diǎn)與我國(guó)地方品種的繁殖力高、肉質(zhì)好、適應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn)結(jié)合在后代中，再通過(guò)連續(xù)不斷的選擇，培育出大量?jī)?yōu)質(zhì)、高效的生豬新品系和配套系。而且到目前為止，雜交技術(shù)也是一項(xiàng)在常規(guī)的商品豬生產(chǎn)中廣泛使用的技術(shù)，用于生產(chǎn)各種經(jīng)濟(jì)性狀均較為理想的雜種商品豬，如杜長(zhǎng)大三元雜交豬等。

但是雜交育種存在明顯的不足。一是不同品種豬雜交后，后代在引入優(yōu)質(zhì)基因的同時(shí)，也引入了大量劣性基因，為了選育出優(yōu)良的雜交后代，必須配備大量的人力并長(zhǎng)期進(jìn)行觀察和測(cè)定。這種選育過(guò)程要不斷持續(xù)幾十年之久。如今風(fēng)靡世界的長(zhǎng)白豬、大白豬等著名品種，都是經(jīng)過(guò)將近百年的選育才培育成功。漫長(zhǎng)的選育過(guò)程導(dǎo)致動(dòng)物新品種培育的人力成本、時(shí)間成本和經(jīng)濟(jì)成本居高不下。

二是常規(guī)的選育方法無(wú)法對(duì)那些難以觀察和測(cè)定的復(fù)雜性狀進(jìn)行選育。比如抗病性狀在不發(fā)病時(shí)無(wú)法觀察，而在持續(xù)攻毒的條件下進(jìn)行測(cè)定和選育又會(huì)對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)造成巨大的感染風(fēng)險(xiǎn)。另外測(cè)定成本較高的飼料轉(zhuǎn)化率性狀、肉質(zhì)性狀以及低遺傳力的繁殖力等性狀，用常規(guī)育種方法進(jìn)行選育不僅成本高、可操作性差，而且選育進(jìn)展也比較緩慢。隨著環(huán)保要求以及消費(fèi)水平的不斷提升，規(guī)?；B(yǎng)殖和優(yōu)良肉質(zhì)品種將是未來(lái)動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)的普遍需求，這就要求動(dòng)物新品種的培育要向高抗病能力、優(yōu)良肉質(zhì)等方向發(fā)展，而這兩方面恰恰是常規(guī)選育方法無(wú)法發(fā)揮其長(zhǎng)處的地方。

三是雜交育種本身的規(guī)律就決定了，即便經(jīng)過(guò)漫長(zhǎng)的選育，劣性基因也不一定能完全從雜交后代中排除。根據(jù)基因的連鎖和交換定律，染色體上相距很近的兩個(gè)基因常常是連鎖在一起的，作為一個(gè)單元進(jìn)行遺傳。所以不管如何延長(zhǎng)選育時(shí)間，那些與優(yōu)質(zhì)基因連鎖的劣性基因依然會(huì)存在。

2 分子編寫育種的內(nèi)容及研究現(xiàn)狀

分子編寫育種是指利用鋅指核酸酶（zinc-finger nucleases, ZFN）[5-6]、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶（transcription activator-like effector nucleases, TALEN）[7-8]]或者CRISPR/Cas等基因組編輯工具對(duì)生物基因組進(jìn)行精確到分子水平的編寫并定向培養(yǎng)新品種的技術(shù)。該技術(shù)最大的特點(diǎn)在于以“高精度”和“高效性”實(shí)現(xiàn)“高安全性”?？梢詫?duì)任何物種基因組的任何位置進(jìn)行精確到單個(gè)堿基的編寫，實(shí)現(xiàn)遺傳序列的精確插入、替換、復(fù)制、刪除等操作，大大降低非預(yù)期效應(yīng)。

分子編寫育種的目的在于：通過(guò)基因組編輯技術(shù)、顯微注射技術(shù)以及體細(xì)胞克隆技術(shù)，高效創(chuàng)制新的遺傳標(biāo)記并快速驗(yàn)證，對(duì)基因組進(jìn)行精確的堿基序列插入、刪除或者替換等操作，實(shí)現(xiàn)物種內(nèi)或者跨物種的遺傳信息的高效、快速整合，進(jìn)而快速獲得目標(biāo)性狀突出的生物個(gè)體或種群，高效培育具有目的性狀的新品種，解決傳統(tǒng)育種中耗時(shí)長(zhǎng)、成本高、效率低的問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)真正意義上的“分子雜交”和“分子育種”。

分子編寫的研究?jī)?nèi)容主要包括：新型育種標(biāo)記的創(chuàng)制及驗(yàn)證、跨物種分子編寫、基因組中堿基序列的刪除以及物種內(nèi)分子編寫等四項(xiàng)（圖1）。

圖1 分子編寫的研究?jī)?nèi)容及育種流程

2.1 新型育種標(biāo)記的創(chuàng)制及驗(yàn)證

遺傳標(biāo)記在育種中發(fā)揮著重要作用，但是目前已發(fā)現(xiàn)的有效的遺傳標(biāo)記如主效基因、因果SNP位點(diǎn)等數(shù)量有限，非常不利于育種產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

分子編寫技術(shù)可以有效的解決這一問(wèn)題。首先，分子編寫技術(shù)可以高通量、大規(guī)模的創(chuàng)制新型的遺傳標(biāo)記。比如創(chuàng)制豬的新型遺傳標(biāo)記可以先構(gòu)建靶向豬全基因組中啟動(dòng)子、內(nèi)含子以及microRNA簇、lncRNA、DNA甲基化區(qū)域等重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的gRNA文庫(kù)，并利用CRISPR蛋白對(duì)這些區(qū)域進(jìn)行隨機(jī)或者連續(xù)編輯，規(guī)模化的產(chǎn)生單堿基或大片段突變，然后進(jìn)行初步的表型篩選，就能獲得大量與目標(biāo)性狀相關(guān)的候選遺傳突變和遺傳標(biāo)記。

另一方面，也可以綜合已有的不同品種豬的基因組數(shù)據(jù)、SNP數(shù)據(jù)、全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果等生物信息學(xué)數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)，篩選與豬抗病、生長(zhǎng)速度、瘦肉率、產(chǎn)仔數(shù)、肉質(zhì)等重要經(jīng)濟(jì)性狀因果相關(guān)或緊密相關(guān)的各種遺傳標(biāo)記（如SNP位點(diǎn)、酶切位點(diǎn)、結(jié)構(gòu)變異、拷貝數(shù)變異等）、表觀遺傳標(biāo)記（如microRNA、lncRNA、DNA甲基化修飾等）。

以上兩種方式獲得的遺傳標(biāo)記，可以進(jìn)一步通過(guò)體細(xì)胞克隆的方法進(jìn)行精準(zhǔn)驗(yàn)證。例如驗(yàn)證SNP位點(diǎn)與目的性狀的相關(guān)性（圖2），就可以先利用分子改編技術(shù)的高精準(zhǔn)性從同一個(gè)細(xì)胞系構(gòu)建出多個(gè)SNP差異細(xì)胞系，然后再利用體細(xì)胞克隆動(dòng)物細(xì)胞核遺傳一致性，構(gòu)建SNP差異群體。這個(gè)群體理論上具有完全一致的遺傳背景，只在目標(biāo)SNP位點(diǎn)存在單堿基差異。進(jìn)一步分析SNP差異群體的表型，就能驗(yàn)證SNP位點(diǎn)與目標(biāo)性狀的相關(guān)性，及其對(duì)目標(biāo)性狀的貢獻(xiàn)度。這種方法避免了全基因組選育中依賴算法造成的統(tǒng)計(jì)學(xué)誤差，能更準(zhǔn)確地驗(yàn)證SNP位點(diǎn)對(duì)目標(biāo)性狀的貢獻(xiàn)度，從而獲得因果SNP位點(diǎn)。

構(gòu)建的SNP差異群體除了可以精準(zhǔn)驗(yàn)證SNP對(duì)目標(biāo)性狀的貢獻(xiàn)外，還可深入研究SNP影響目標(biāo)性狀分子機(jī)制，以及挖掘與目標(biāo)性狀相關(guān)的其他遺傳標(biāo)記的好材料。比如在同一品種、同一來(lái)源的細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)單核苷酸的“轉(zhuǎn)換”或“顛換”培育的SNP差異群體，它們?cè)谶z傳背景上基本完全一致，這時(shí)不僅可以直接驗(yàn)證SNP對(duì)目標(biāo)性狀的貢獻(xiàn)度，還可以通過(guò)高通量測(cè)序、功能基因組學(xué)及表觀遺傳學(xué)深入分析其分子機(jī)制。

而在不同品種間的細(xì)胞中分別實(shí)現(xiàn)單核苷酸的“轉(zhuǎn)換”或“顛換”培育的SNP差異群體，其SNP變異相同，但遺傳背景不同，這時(shí)就可以深入挖掘、篩查與目標(biāo)性狀相關(guān)的其他遺傳標(biāo)記（圖2）。

綜上所述，利用分子編寫技術(shù)不僅能規(guī)?；木珳?zhǔn)創(chuàng)制遺傳突變，便于發(fā)現(xiàn)新型遺傳標(biāo)記，更可以精準(zhǔn)驗(yàn)證SNP位點(diǎn)對(duì)目標(biāo)性狀的貢獻(xiàn)度，改變目前全基因組選育中完全依賴算法造成的統(tǒng)計(jì)學(xué)誤差，從而獲得一批具有高度育種價(jià)值的因果SNP位點(diǎn)，形成自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)及核心技術(shù)。另外在進(jìn)行SNP驗(yàn)證時(shí)，還可以進(jìn)一步解析SNP位點(diǎn)影響目標(biāo)性狀的分子機(jī)制，挖掘和篩查與目標(biāo)性狀相關(guān)的其他遺傳標(biāo)記。

圖2 通過(guò)分子編寫技術(shù)進(jìn)行SNP位點(diǎn)的規(guī)?；?yàn)證

2.2 跨物種分子編寫育種

跨物種分子編寫育種，即通過(guò)ZFN、TALEN或者CRISPR/Cas系統(tǒng)以及顯微注射技術(shù)、體細(xì)胞核移植技術(shù)將一個(gè)物種中的基因精確插入或替換到另外一個(gè)物種基因組的特定位置中，或者在一個(gè)物種的基因組特定位置上，模仿另一個(gè)物種基因組中特定位置的堿基序列信息。常見的是將外源基因插入或替換到某一物種基因組上的特定位點(diǎn)中，如友好基因座中。該方法不僅能打破物種間的生殖隔離，引入外物種的優(yōu)良基因，而且能在大大降低非預(yù)期效應(yīng)的同時(shí)，充分發(fā)揮外源基因的育種價(jià)值?，F(xiàn)有的跨物種分子編寫育種研究可以分為以下三類：外物種基因的精確插入，外物種基因的精確替換以及外物種突變序列的模仿。

2.2.1 外物種基因的精確插入 外物種基因的精確插入目前已有報(bào)道。其主要方法是將具有特殊功能的外源基因的完整表達(dá)框，精確的定點(diǎn)整合到受體動(dòng)物基因組中的特定位置中。使其整合位置以及表達(dá)模式完全可控，避免傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的非預(yù)期效應(yīng)的產(chǎn)生。目前常選擇動(dòng)物基因組中的“友好基因座（safe harbor）”進(jìn)行定點(diǎn)整合。友好基因座是指動(dòng)物基因組中轉(zhuǎn)錄活躍且不影響動(dòng)物生長(zhǎng)、發(fā)育和生殖的基因位點(diǎn)，這些位點(diǎn)非常適合外源基因的表達(dá)，對(duì)外源基因是友好的，因此稱為友好基因座。在開發(fā)和利用友好基因座進(jìn)行外物種基因的精確插入方面，我國(guó)的科研工作者走在了世界前列。中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院鑒定出豬的Rosa26友好基因座，并在該位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)外源基因的定點(diǎn)插入和替換[9]。

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所鑒定出豬的一個(gè)新型友好基因座H11位點(diǎn)，并利用CRISPR/Cas技術(shù)高效、準(zhǔn)確的在該位點(diǎn)定點(diǎn)插入長(zhǎng)達(dá)9.4 kb的外源基因片段[10]。同時(shí)，該團(tuán)隊(duì)還進(jìn)一步制備了兩種在該友好位點(diǎn)分別插入三個(gè)基因的II型糖尿病模型豬：轉(zhuǎn)GIPRdn-hIAPP-11β-HSD1巴馬豬和轉(zhuǎn)GIPRdn-hIAPP-PNPLA3 I148M巴馬豬，該項(xiàng)研究首次在國(guó)際上創(chuàng)制胰島β細(xì)胞和肝臟特異性表達(dá)多基因小型豬2型糖尿病模型，并率先在國(guó)際上利用基因組編輯技術(shù)創(chuàng)制定點(diǎn)敲入大片段基因工程豬(數(shù)據(jù)暫未發(fā)表)。

西北農(nóng)林科技大學(xué)利用CRISPR/Cas9n切口酶系統(tǒng)將結(jié)核抗性基因NRAMP1定點(diǎn)整合到奶?；蚪M的友好基因座F-A位點(diǎn)中，不僅建立了一套高效、低脫靶率的將外物種基因精確插入奶?；蚪M的技術(shù)體系[11]，而且有望利用此成果培育出抗牛結(jié)核病的新型奶牛品種，市場(chǎng)潛力巨大。

2.2.2 外物種基因的精確替換 在外物種基因的精確替換方面，美國(guó)密蘇里大學(xué)通過(guò)CRISPR/Cas技術(shù)將豬CD163基因的第7外顯子精確替換為人的同源序列[12]。豬CD163蛋白是巨噬細(xì)胞表面的一種蛋白，在豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）感染過(guò)程中能介導(dǎo)PRRSV病毒進(jìn)入巨噬細(xì)胞，而人的同源蛋白卻不介導(dǎo)PRRSV的感染，從而使得PRRSV病毒無(wú)法感染人類。該研究精確替換了CD163基因的第7外顯子，不僅能深入探索PRRSV病毒感染機(jī)制，更有望在保留豬CD163蛋白基本功能的前提下，刪除CD163對(duì)PRRSV病毒的介導(dǎo)作用，從而培育出既能抵抗PRRSV病毒，又不會(huì)因CD163敲除而可能攜帶某些缺陷的新型抗病豬。

2.2.3 外物種突變序列的模仿 除了外物種基因的精確插入和替換外，還可以通過(guò)精細(xì)的模仿外物種堿基突變培育動(dòng)物新品種。這一方面我國(guó)的研究也處于世界前列。肌肉生成抑制素（myostatin, MSTN），也稱為生長(zhǎng)分化因子8（growth and differentiation factor 8, GDF8）是一種肌肉生長(zhǎng)的負(fù)性調(diào)控因子。世界著名的比利時(shí)藍(lán)牛，正是由于MSTN基因第三外顯子上11個(gè)堿基的缺失，形成了提前終止密碼子，造成了其“雙肌臀”表型[13]。比利時(shí)藍(lán)牛肌肉量特別豐富，屠宰率最高達(dá)71%，比其他品種牛多提供肌肉18%—20%。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所使用ZFN技術(shù)和TALEN技術(shù)在大白豬體內(nèi)模擬比利時(shí)藍(lán)牛MSTN基因的自然突變，獲得“仿比利時(shí)藍(lán)牛MSTN基因突變”的大白豬。這種“仿比利時(shí)藍(lán)牛MSTN基因突變豬”經(jīng)過(guò)精確的基因編輯，所攜帶的MSTN基因突變類型與比利時(shí)藍(lán)牛的自然突變完全一致，從而在提高肌肉量、降低脂肪沉積、提高生長(zhǎng)速度的同時(shí)進(jìn)一步降低了MSTN基因突變可能引起的不良效應(yīng)，具有重要的應(yīng)用價(jià)值和良好的商業(yè)前景。目前，該基因編輯新品種豬已經(jīng)順利完成中間試驗(yàn)（數(shù)據(jù)暫未發(fā)表）。

在抗病育種方面，英國(guó)羅斯林研究所研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)：非洲疣豬通常會(huì)攜帶非洲豬瘟病毒，卻不發(fā)病，而家豬在感染非洲豬瘟病毒后，在很短的時(shí)間內(nèi)就會(huì)發(fā)病倒下?；蚪M測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，與感染非洲豬瘟病毒相關(guān)的一個(gè)關(guān)鍵基因RELA在家豬和非洲疣豬中存在3個(gè)不同的SNP位點(diǎn)，這可能是家豬易感豬瘟病毒的一個(gè)重要遺傳差異。非洲疣豬與家豬同屬豬科，但是屬于不同的亞科。家豬屬于豬亞科，非洲疣豬屬于疣豬亞科。該團(tuán)隊(duì)利用ZFN技術(shù)，成功地將家豬RELA基因的3個(gè)SNP更改為非洲疣豬的SNP，有希望獲得天然抵抗非洲豬瘟病毒的基因編輯豬[14]。

2.3 基因組中堿基序列的刪除

分子編寫育種的第二方面是：基因組中堿基序列的刪除。除了打破生殖隔離，跨物種的引入基因或堿基突變外，分子編寫育種還包括在同一物種內(nèi)對(duì)基因組進(jìn)行精細(xì)操作，精確刪除基因組上的某些無(wú)用甚至有害的堿基序列。比如在進(jìn)化中整合到基因組上的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒、導(dǎo)致應(yīng)激綜合征的基因、疾病易感基因以及某些病毒或細(xì)菌的受體基因等。將這些基因或序列精確的剔除掉，就能定向培育出更為優(yōu)質(zhì)，更符合人類養(yǎng)殖、食用、醫(yī)藥研發(fā)等多種不同需求的生物新品種。

2.3.1 內(nèi)源性冗余序列的刪除 豬的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒是在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中整合到豬基因組中的，對(duì)豬本身已經(jīng)沒有毒性，但是在進(jìn)行異種器官移植時(shí)卻有可能對(duì)人體安全造成威脅。通過(guò)分子編寫，美國(guó)哈佛大學(xué)的楊璐菡?qǐng)F(tuán)隊(duì)成功刪除了豬基因組中幾乎全部的逆轉(zhuǎn)錄病毒序列，并通過(guò)體細(xì)胞克隆技術(shù)獲得了世界上首批適合進(jìn)行異種器官移植的無(wú)內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的小型豬[15-16]，該研究對(duì)培育異種器官移植用小型豬新品種具有重大意義。同樣，通過(guò)分子編寫技術(shù)，刪除其他物種基因組中的內(nèi)源性病毒序列，也能夠培育出更安全，適用于醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用的生物新品種。

2.3.2 負(fù)作用基因和因子的刪除 除刪除內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒外，通過(guò)分子編寫技術(shù)刪除基因組中某些負(fù)調(diào)控基因和因子，同樣可實(shí)現(xiàn)相應(yīng)性狀的快速改良。如豬、牛、羊基因組中的MSTN基因?qū)∪馍L(zhǎng)具有抑制作用，刪除該基因可提高動(dòng)物的產(chǎn)肉量。早在2012年，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所就通過(guò)ZFN技術(shù)獲得了MSTN基因敲除梅山豬，其瘦肉率顯著提高。至今已繁育到第五代，并且已獲準(zhǔn)開展轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)環(huán)境釋放試驗(yàn)。2014年，該單位又利用TALEN技術(shù)精確模擬比利時(shí)藍(lán)牛的MSTN基因突變，獲得了“仿比利時(shí)藍(lán)牛MSTN基因突變”的大白豬初代群。 2015年，中國(guó)科學(xué)家與韓國(guó)科學(xué)家合作利用TALEN技術(shù)獲得具有顯著“雙肌臀”表型的MSTN基因編輯豬[17]。之后，吉林大學(xué)[18]和湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所[19]又分別利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功制備了MSTN基因編輯豬。除MSTN基因敲除新品種豬外，利用CRISPR/Cas9技術(shù)還可獲得MSTN基因敲除綿羊、山羊、兔等高產(chǎn)肉率新品種動(dòng)物。

牛奶和羊奶中的β-乳球蛋白是人乳中不含有的蛋白，是奶制品中的過(guò)敏原之一。通過(guò)分子編寫技術(shù)將牛或羊基因組中的β-乳球蛋白基因敲除[20]，從而可降低牛羊乳中過(guò)敏原的含量，培育出不含β-乳球蛋白的牛羊新品種，緩解部分人群牛乳過(guò)敏癥狀。2011年，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)利用ZFN技術(shù)成功敲除?；蚪M中的β-乳球蛋白基因，獲得β-乳球蛋白敲除的奶牛，為培育低過(guò)敏原奶牛打下了良好的基礎(chǔ)。

2.3.3 與疾病易感相關(guān)基因和因子的刪除 抗病能力是動(dòng)物育種中具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的一種表型。但是傳統(tǒng)育種手段在選育抗病品種時(shí)缺乏合適的指示性狀，而攻毒后再測(cè)定則成本高昂，并會(huì)對(duì)生產(chǎn)有不利影響。分子標(biāo)記輔助育種存在分子標(biāo)記較少，各個(gè)抗病分子標(biāo)記間的關(guān)系復(fù)雜，抗病性狀與部分生產(chǎn)性狀存在拮抗等多種問(wèn)題。因此抗病動(dòng)物品種的培育工作一直進(jìn)展緩慢。而分子編寫育種則可以通過(guò)直接刪除疾病易感基因或者病毒受體基因，快速培育具有抗病性狀的動(dòng)物新品種，將大大加快抗病動(dòng)物新品種的培育速度。

動(dòng)物傳染性海綿狀腦?。╰ransmissible spongiform encephalopathy, TSE）是一種可以感染人類和牛、羊等動(dòng)物的致死性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。這種疾病不僅對(duì)牛、羊等動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失，還直接威脅著人類健康。通過(guò)動(dòng)物分子編寫技術(shù)，敲除動(dòng)物中引起TSE疾病的PRNP基因，就能獲得抗TSE的動(dòng)物。如敲除PRNP基因的抗瘋牛病牛[21]，和抗羊瘙癢病綿羊[22]、山羊[23-24]等動(dòng)物新品種。這類抗TSE動(dòng)物新品種的進(jìn)一步推廣和應(yīng)用，將會(huì)大大提升畜牧業(yè)生產(chǎn)和人類健康的安全保障。

豬繁殖與呼吸綜合征又稱為豬藍(lán)耳病，是嚴(yán)重威脅豬養(yǎng)殖業(yè)的頭號(hào)烈性傳染病。該病由一種小RNA病毒引起，變異速度快，防控難度大。從2014年開始，美國(guó)密蘇里大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)利用基因組編輯技術(shù)先后敲除了與PRRSV病毒感染相關(guān)的CD169和CD163基因，獲得了CD169和CD163基因敲除豬。攻毒實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CD163雙等位基因敲除豬對(duì)PRRSV具有完全抗性[25-28]，就是說(shuō)CD163基因敲除豬能夠完全抵抗豬藍(lán)耳病。國(guó)際著名豬育種公司Genus plc（www.genusplc.com）已經(jīng)與密蘇里大學(xué)合作，開展抗藍(lán)耳病新品種豬的培育工作，該公司在2015年宣布計(jì)劃用5年時(shí)間將抗藍(lán)耳病新品種豬提供給豬肉生產(chǎn)商。截止到2017年12月，該公司已相繼拿到CD163基因、分子剪刀等知識(shí)產(chǎn)權(quán)許可，并培育出祖代抗藍(lán)耳病豬群體，整體培育工作進(jìn)展順利（圖3）。

圖3 Genus pIc公司抗藍(lán)耳病豬開發(fā)時(shí)間表（數(shù)據(jù)源自Genus pIc公司網(wǎng)站）

2.4 物種內(nèi)分子編寫育種

分子編寫育種的第三方面是：物種內(nèi)分子編寫育種。常規(guī)的雜交育種手段無(wú)法精確的將“好基因”和“壞基因”分開，因此往往在導(dǎo)入優(yōu)質(zhì)基因的同時(shí)也導(dǎo)入了大量的劣性基因。尤其是那些互相連鎖的基因，常規(guī)的雜交育種手段是無(wú)法分開的。物種內(nèi)分子編寫育種就能解決這一問(wèn)題。分子編寫育種可以在同一物種內(nèi)對(duì)動(dòng)物基因組進(jìn)行精細(xì)操作，模仿同一物種中其他品種上的堿基突變或SNP位點(diǎn)，將多個(gè)品種的優(yōu)質(zhì)遺傳突變信息，如基因突變以及啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、內(nèi)含子等多種非編碼區(qū)域上的SNP位點(diǎn)、突變序列等模仿和替換到一個(gè)品種上，實(shí)現(xiàn)真正意義上的“分子雜交”。

比如在豬的育種中，分子編寫育種可以精確的將地方豬的肉質(zhì)優(yōu)良、抗逆性強(qiáng)的基因替換到商用品種中，或者將商用品種生長(zhǎng)速度快、飼料利用率高、瘦肉率高的基因替換到地方品種中。甚至可以精確的實(shí)現(xiàn)品種間、個(gè)體間堿基突變或SNP位點(diǎn)的模仿，直接獲得分子雜種優(yōu)勢(shì)，替代有性雜交，實(shí)現(xiàn)真正的豬個(gè)體和群體水平的“分子雜交”育種。

通過(guò)對(duì)“瘦肉型”和“肥肉型”豬的QTL分析發(fā)現(xiàn)，“瘦肉型”豬（如大白豬、皮特藍(lán)豬）與“肥肉型”豬（如野豬、梅山豬）相比，其類胰島素生長(zhǎng)因子2（Insulin-like growth factor 2, IGF2）的第三內(nèi)含子的第3072位堿基存在G到A的SNP位點(diǎn)，該SNP位點(diǎn)對(duì)豬的生長(zhǎng)速度、瘦肉率、背膘厚、背最長(zhǎng)肌面積以及心臟重量等性狀有著非常顯著的影響，可以使豬的肌肉量增加15%—30%，背膘厚減少10%—20%[29]。該SNP位點(diǎn)應(yīng)該是在“瘦肉型”豬的培育過(guò)程中自然突變后經(jīng)過(guò)漫長(zhǎng)的人工選育固定下來(lái)的。如果通過(guò)物種內(nèi)分子編寫育種，將該SNP位點(diǎn)直接精確的引入到我國(guó)地方品種豬中，就能快速的提高我國(guó)地方品種豬的產(chǎn)肉性能，對(duì)我國(guó)地方品種豬的改良意義重大。

在歐洲和美國(guó)的奶牛養(yǎng)殖業(yè)中，常常出于生產(chǎn)安全以及對(duì)工作人員的保護(hù)將奶牛的角去掉。但是去角的過(guò)程不僅增加了養(yǎng)殖成本，對(duì)奶牛來(lái)說(shuō)也非常痛苦，與動(dòng)物福利和動(dòng)物保護(hù)的宗旨不符[30]。目前已選育出某些肉用品種的牛有無(wú)角性狀，如安格斯肉牛（Angus cattle）[31]，其無(wú)角性狀主要由1號(hào)染色體上的POLLED基因決定[32]。如果通過(guò)雜交育種的方法培育無(wú)角奶牛，不僅需要非常長(zhǎng)的選育時(shí)間，而且雜交后代的產(chǎn)奶性能一定會(huì)受到肉牛某些基因的影響，產(chǎn)奶性能會(huì)降低。Tan等利用TALEN技術(shù)成功將肉牛的無(wú)角基因定點(diǎn)整合到有角奶牛的基因組中，由此可培育出既保持高生產(chǎn)性能，又無(wú)角的奶牛新品種，免除了奶牛切角的痛苦[33]。

禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）極大的威脅著禽類養(yǎng)殖業(yè)和人類健康。培育能抵抗禽流感的禽類動(dòng)物，一直以來(lái)都是養(yǎng)殖和育種從業(yè)人員的夢(mèng)想。2011年，英國(guó)羅斯林研究所通過(guò)轉(zhuǎn)入干擾RNA來(lái)抑制禽流感病毒的增殖[34]，獲得了較好的抗病效果。未來(lái)則可以借助分子編寫技術(shù)，將其他品種中對(duì)禽流感病毒有抵抗力的基因[35]直接模仿和替換到生產(chǎn)性能較高的品種上，進(jìn)而快速獲得對(duì)禽流感病毒具有一定抵抗力的新品種動(dòng)物。

2015年，一種能快速生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因三文魚——水優(yōu)三文魚（aquAdvantage salmon）通過(guò)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（food and drug administration, FDA）的審批，獲準(zhǔn)上市銷售[36-37]。2017年，首批水優(yōu)三文魚已經(jīng)正式上市銷售[38]。這種三文魚本身為大西洋三文魚（atlantic salmon），轉(zhuǎn)入了另外一種三文魚——大鱗三文魚（chinook salmon）的一個(gè)生長(zhǎng)激素調(diào)節(jié)基因，以及一個(gè)來(lái)自美洲大綿鳚（ocean pout）的啟動(dòng)子，用來(lái)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)激素的合成，從而使得它們能夠全年生長(zhǎng)，因此生長(zhǎng)速度比普通三文魚快一倍，節(jié)省約75%的飼料。該品種采用的是傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，因此經(jīng)歷了較為漫長(zhǎng)的審批過(guò)程。如果采用品種內(nèi)分子編寫技術(shù)，將其他品種三文魚的優(yōu)質(zhì)基因或啟動(dòng)子序列替換到大西洋三文魚中，相信將更加容易獲得消費(fèi)者的認(rèn)可。

3 分子編寫育種流程

分子編寫育種的目的是改良品種并將優(yōu)良的遺傳基因傳遞至商品代。因此除了上述的對(duì)動(dòng)物基因組的分子操作外，分子編寫育種還需要緊密結(jié)合目前廣泛使用的常規(guī)育種方法，持續(xù)對(duì)分子編寫群體進(jìn)行選配、測(cè)定、評(píng)估，根據(jù)評(píng)估結(jié)果選擇優(yōu)良個(gè)體建立核心群（圖1）。然后依次建立純種擴(kuò)繁群商品生產(chǎn)群，將優(yōu)良基因傳遞給商品群。在核心群的建立和維持過(guò)程中，測(cè)定和評(píng)估是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。不僅要進(jìn)行性能測(cè)定、體型評(píng)估等常規(guī)測(cè)定，還需要進(jìn)行基因測(cè)定，獲取其遺傳標(biāo)記信息，以便通過(guò)全基因組選擇和測(cè)序分型進(jìn)行更準(zhǔn)確的選種。也就是說(shuō)，通過(guò)分子編寫技術(shù)獲得的、遺傳性狀得到“質(zhì)變”的群體，還需要結(jié)合全基因組選擇、標(biāo)記輔助選擇等多種育種方法進(jìn)一步不斷選育、不斷迭代、不斷積累“量變”，才能保持遺傳性狀的優(yōu)良。

4 分子編寫育種的前景

綜上所述，分子編寫育種一方面可以在物種間實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)基因或序列甚至是SNP的流動(dòng)、替換，打破物種間的生殖隔離，充分發(fā)揮優(yōu)質(zhì)基因的育種價(jià)值。另一方面可以在物種內(nèi)真正實(shí)現(xiàn)個(gè)體和群體水平的分子雜交育種，快速獲得具有分子雜種優(yōu)勢(shì)的生物新品種?？缥锓N分子編寫育種與轉(zhuǎn)基因技術(shù)相比，精確性大大提高，因此可以大大降低外源基因隨機(jī)整合以及表達(dá)量不可控導(dǎo)致的非預(yù)期效應(yīng)，更加精準(zhǔn)，更加高效，更加安全。而物種內(nèi)的動(dòng)物分子編寫育種，在真正實(shí)現(xiàn)分子雜交的同時(shí)，完全不含其他物種的DNA序列，在本質(zhì)上與傳統(tǒng)育種方法獲得的個(gè)體完全沒有差異，可以說(shuō)等同于傳統(tǒng)育種方法獲得的遺傳變異個(gè)體。

盡管分子編寫育種具有諸多優(yōu)勢(shì)，但目前尚有兩方面的問(wèn)題需要進(jìn)一步解決。一是基因編輯技術(shù)的準(zhǔn)確性及特異性。分子編寫技術(shù)所依賴的基因組操作工具——ZFN、TALEN和CRISPR/Cas等技術(shù)發(fā)展迅速，其精確性和特異性都在不斷提高。如通過(guò)Scr7抑制小鼠細(xì)胞中的非同源末端連接修復(fù)（non-homologous end joining, NHEJ）可將精確修復(fù)的效率提高數(shù)倍甚至數(shù)十倍[39-40]，除抑制NHEJ修復(fù)外，還可以通過(guò)直接增強(qiáng)同源重組修復(fù)（homology directed repair, HDR）以提高精確修復(fù)的比率，主要方法有調(diào)控細(xì)胞周期[39, 41]、引入外源性DNA[42]、對(duì)sgRNA進(jìn)行化學(xué)修飾[43]或利用小分子化合物激活HDR[44]等。除了以上幾種增強(qiáng)精確修復(fù)的方法，還可以利用胞嘧啶核苷脫氨酶[45]或堿基修飾酶[46]與Cas9蛋白直接融合，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)胞嘧啶到胸腺嘧啶的直接轉(zhuǎn)換。

除不斷提高CRISPR/Cas技術(shù)的精確修復(fù)能力外，CRISPR/Cas技術(shù)的特異性也已經(jīng)得到極大的改善。主要優(yōu)化方法可分為對(duì)Cas9蛋白的改造和針對(duì)sgRNA的改進(jìn)。在Cas9蛋白的改造方面，其主要策略包括將Cas9蛋白的核酸內(nèi)切酶失活，只保留DNA識(shí)別能力，同時(shí)與其他核酸內(nèi)切酶融合形成復(fù)合體，如FokⅠ-dCas9復(fù)合體[47-48]，進(jìn)而提高對(duì)靶序列切割的特異性。其次是對(duì)Cas9蛋白進(jìn)行點(diǎn)突變，篩選與DNA結(jié)合特異性更高的突變體，如增強(qiáng)型eSpCas9[49]、高保真型Cas9-HF1[50]等。針對(duì)sgRNA的改造是改變sgRNA的長(zhǎng)度，研究表明在sgRNA的5'端的減少2—3個(gè)堿基[51]或在識(shí)別序列前加2個(gè)鳥嘌呤[52]，能夠在不影響切割活性的情況下，降低脫靶率大約5 000倍。

第二方面是政府監(jiān)管措施及公眾接受度。由于基因編輯技術(shù)發(fā)展的速度太快，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了人們對(duì)其了解和熟悉的速度，不僅科學(xué)界對(duì)基因編輯作物是否屬于轉(zhuǎn)基因生物（genetically modified organism, GMO）尚未有明確的定論，而且全球多數(shù)國(guó)家的監(jiān)管標(biāo)準(zhǔn)也尚未明確。2016年《Nature genetics》發(fā)表評(píng)述文章[53]，提出了5項(xiàng)基因編輯作物的管理框架，該框架對(duì)基因編輯作物的管理提出了系統(tǒng)性的建議，在最大限度減少基因編輯作物傳播風(fēng)險(xiǎn)的同時(shí)，建議“以和常規(guī)育種作物相同的制度來(lái)管理基因組編輯作物”從而簡(jiǎn)化基因編輯作物的管理，以加快基因編輯作物的商業(yè)化應(yīng)用。目前，美國(guó)農(nóng)業(yè)部對(duì)于通過(guò)基因編輯工具生產(chǎn)的、不含有外源基因的食品免于監(jiān)管。如2016年美國(guó)農(nóng)業(yè)部就宣布免除對(duì)CRISPR/Cas9技術(shù)編輯的抗褐變蘑菇的監(jiān)管[5]。而轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在美國(guó)是作為藥物受FDA監(jiān)管，且FDA聲明基因組編輯動(dòng)物依然要受其監(jiān)管。而澳大利亞、新西蘭和阿根廷等國(guó)家對(duì)不含有外源基因的產(chǎn)品免于監(jiān)管，對(duì)于有少數(shù)DNA堿基插入的產(chǎn)品實(shí)行個(gè)案分析原則，對(duì)于有大片段插入的食品則進(jìn)行嚴(yán)格監(jiān)管。

2018年中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞研究員發(fā)表評(píng)述文章[55]，認(rèn)為政府監(jiān)管措施和公眾接受度是影響基因編輯技術(shù)農(nóng)業(yè)應(yīng)用的最大因素，全球監(jiān)管環(huán)境的不確定性限制了將該技術(shù)進(jìn)行應(yīng)用的信心。同時(shí)她認(rèn)為目前基因編輯技術(shù)所取得的成就只是冰山一角，這種新型育種技術(shù)將為農(nóng)業(yè)帶來(lái)可持續(xù)發(fā)展的未來(lái)。因此，我們有理由相信，隨著基因編輯工具的不斷更新，分子編寫育種也將不斷的發(fā)展與成熟，其安全性和優(yōu)越性將進(jìn)一步被消費(fèi)者認(rèn)識(shí)和熟知。未來(lái)的分子編寫品種和產(chǎn)品將會(huì)越來(lái)越多，動(dòng)物育種將迎來(lái)全新的發(fā)展機(jī)遇，為人類提供更加優(yōu)質(zhì)、健康的產(chǎn)品。

[1] MUSUNURU K. The hope and hype of CRISPR-Cas9 genome editing: A review, 2017, 2(8): 914-919.

[2] 劉志國(guó). CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)基因編輯的研究進(jìn)展畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2014, 45(10): 1567-1583.

LIU Z G. Research progress on CRISPR/Cas9 mediated genome editing., 2014, 45(10): 1567-1583.(in Chinese)

[3] RUAN J X, XU J, CHEN-TSAI R Y, LI K. Genome editing in livestock: Are we ready for a revolution in animal breeding industry?, 2017, 26(6): 715-726.

[4] TELUGU B P, PARK K-E,PARK C-H. Genome editing and genetic engineering in livestock for advancing agricultural and biomedical applications, 2017, 28(7-8): 338-347.

[5] M NORET S, TESSON L, REMY S, USAL C, OUISSE L-H, BRUSSELLE L, CHENOUARD V,ANEGON I. Advances in transgenic animal models and techniques, 2017, 26(5): 703-708.

[6] DEKELVER R, OU L, LAOHARAWEE K, TOM S, RADEKE R, ROHDE M, SPROUL S, PRZYBILLA M, KONIAR B L, PODETZ-PEDERSEN K, COOKSLEY R D, HOLMES M C, MCIVOR R S, WHITLEY C B,WECHSLER T. ZFN-mediated in vivo genome editing results in phenotypic correction in murine MPS I and MPS II models, 2017, 120(1): S41.

[7] TAYLOR L, CARLSON D F, NANDI S, SHERMAN A, FAHRENKRUG S C,MCGREW M J. Efficient TALEN-mediated gene targeting of chicken primordial germ cells, 2017, 144(5): 928.

[8] CHEN Y, YU J, NIU Y, QIN D, LIU H, LI G, HU Y, WANG J, LU Y, KANG Y, JIANG Y, WU K, LI S, WEI J, HE J, WANG J, LIU X, LUO Y, SI C, BAI R, ZHANG K, LIU J, HUANG S, CHEN Z,

WANG S, CHEN X, BAO X, ZHANG Q, LI F, GENG R, LIANG A, SHEN D, JIANG T, HU X, MA Y, JI W,SUN Y E. Modeling rett syndrome using TALEN-edited MECP2 mutant cynomolgus monkeys, 2017, 169(5): 945-955.e10.

[9] LI X P, YANG Y, BU L, GUO X G, TANG C C, SONG J, FAN N N, ZHAO B T, OUYANG Z, LIU Z M, ZHAO Y, YI X L, QUAN L Q, LIU S C, YANG Z G, OUYANG H, CHEN Y E, WANG Z, LAI L X. Rosa26-targeted swine models for stable gene over-expression and Cre-mediated lineage tracing, 2014, 24(4): 501-504.

[10] RUAN J, LI H, XU K, WU T, WEI J, ZHOU R, LIU Z, MU Y, YANG S, OUYANG H, CHEN-TSAI R Y,LI K. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated transgene knockin at the H11 locus in pigs, 2015, 5: 14253.

[11] GAO Y, WU H, WANG Y, LIU X, CHEN L, LI Q, CUI C, LIU X, ZHANG J,ZHANG Y. Single Cas9 nickase induced generation of NRAMP1 knockin cattle with reduced off-target effects, 2017, 18(1): 13-13.

[12] WELLS K D, BARDOT R, WHITWORTH K M, TRIBLE B R, FANG Y, MILEHAM A, KERRIGAN M A, SAMUEL M S, PRATHER R S,ROWLAND R R. Replacement of porcine CD163 scavenger receptor cysteine-rich domain 5 with a CD163-like homolog confers resistance of pigs to genotype 1 but not genotype 2 porcine reproductive and respiratory syndrome virus, 2017, 91(2):e01521.

[13] GROBET L, ROYO MARTIN L J, PONCELET D, PIROTTIN D, BROUWERS B, RIQUET J, SCHOEBERLEIN A, DUNNER S, MENISSIER F, MASSABANDA J, FRIES R, HANSET R,GEORGES M. A deletion in the bovine myostatin gene causes the double-muscled phenotype in cattle, 1997, 17(1): 71-74.

[14] LILLICO S G, PROUDFOOT C, KING T J, TAN W, ZHANG L, MARDJUKI R, PASCHON D E, REBAR E J, URNOV F D, MILEHAM A J, MCLAREN D G,WHITELAW C B A. Mammalian interspecies substitution of immune modulatory alleles by genome editing, 2016, 6: 21645.

[15] YANG L H, G ELL M, NIU D, GEORGE H, LESHA E, GRISHIN D, AACH J, SHROCK E, XU W, POCI J, CORTAZIO R, WILKINSON R A, FISHMAN J A,CHURCH G. Genome-wide inactivation of porcine endogenous retroviruses (PERVs), 2015, 350(6264): 1101.

[16] NIU D, WEI H-J, LIN L, GEORGE H, WANG T, LEE I H, ZHAO H-Y, WANG Y, KAN Y, SHROCK E, LESHA E, WANG G, LUO Y, QING Y, JIAO D, ZHAO H, ZHOU X, WANG S, WEI H, G ELL M, CHURCH G M,YANG L. Inactivation of porcine endogenous retrovirus in pigs using CRISPR-Cas9, 2017.

[17] DAVID C. Super-muscly pigs created by small genetic tweak, 2015, (523): 13-14.

[18] WANG K K, OUYANG H, XIE Z C, YAO C G, GUO N N, LI M J, JIAO H P,PANG D X. Efficient generation of myostatin mutations in pigs using the CRISPR/Cas9 system, 2015, 5: 16623.

[19] BI Y, HUA Z, LIU X, HUA W, REN H, XIAO H, ZHANG L, LI L, WANG Z, LAIBLE G, WANG Y, DONG F,ZHENG X. Isozygous and selectable marker-free MSTN knockout cloned pigs generated by the combined use of CRISPR/Cas9 and Cre/LoxP, 2016, 6: 31729.

[20] YU S, LUO J, SONG Z, DING F, DAI Y, LI N. Highly efficient modification of beta-lactoglobulin (BLG) gene via zinc-finger nucleases in cattle, 2011, 21(11): 1638-1640.

[21] KUROIWA Y, KASINATHAN P, MATSUSHITA H, SATHIYASELAN J,SULLIVAN E J, KAKITANI M, TOMIZUKA K, ISHIDA I,ROBL J M. Sequential targeting of the genes encoding immunoglobulin- mu and prion protein in cattle, 2004, 36(7): 775-780.

[22] DENNING C, BURL S, AINSLIE A, BRACKEN J, DINNYES A, FLETCHER J, KING T, RITCHIE M, RITCHIE W A, ROLLO M, DE SOUSA P, TRAVERS A, WILMUT I,CLARK A J. Deletion of the alpha(1,3)galactosyl transferase (GGTA1) gene and the prion protein (PrP) gene in sheep, 2001, 19(6): 559-562.

[23] YU G, CHEN J, YU H, LIU S, CHEN J, XU X, SHA H, ZHANG X, WU G, XU S,CHENG G. Functional disruption of the prion protein gene in cloned goats, 2006, 87(4): 1019-1027.

[24] ZHU C, LI B, YU G, CHEN J, YU H, CHEN J, XU X, WU Y, ZHANG A,CHENG G. Production of Prnp-/- goats by gene targeting in adult fibroblasts, 2009, 18(2): 163-171.

[25] WHITWORTH K M, ROWLAND R R, EWEN C L, TRIBLE B R, KERRIGAN M A, CINO-OZUNA A G, SAMUEL M S, LIGHTNER J E, MCLAREN D G, MILEHAM A J, WELLS K D,PRATHER R S. Gene-edited pigs are protected from porcine reproductive and respiratory syndrome virus, 2015, 34(1): 20-22.

[26] BURKARD C, LILLICO S G, REID E, JACKSON B, MILEHAM A J, AIT-ALI T, WHITELAW C B, ARCHIBALD A L. Precision engineering for PRRSV resistance in pigs: Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fully resistant to both PRRSV genotypes while maintaining biological function, 2017, 13(2): e1006206.

[27] WHITWORTH K M, LEE K, BENNE J A, BEATON B P, SPATE L D, MURPHY S L, SAMUEL M S, MAO J, O'GORMAN C, WALTERS E M, MURPHY C N, DRIVER J, MILEHAM A, MCLAREN D, WELLS K D,PRATHER R S. Use of the CRISPR/Cas9 system to produce genetically engineered pigs from-derived oocytes and embryos, 2014, 91(3): 1-13.

[28] 魏迎輝, 劉志國(guó), 徐奎, EVANNA HUYHN, PAUL DYCE, 李繼良, 周偉良, 董樹仁, 馮保亮, 牟玉蓮, JULANG LI, 李奎. CD163雙等位基因編輯豬的制備及傳代. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2018, 51(4): 770-777.

WEI Y H, LIU Z G, XU K, EVANNA H, PAUL D, LI J L, ZHOU W L, DONG S R, FENG B L, MU Y L, LI J, LI K. Generation and propagation of cluster of differentiation 163 biallelic gene editing pigs, 2018, 51(4): 770-777.（in Chinese）

[29] VAN LAERE A S, NGUYEN M, BRAUNSCHWEIG M, NEZER C, COLLETTE C, MOREAU L, ARCHIBALD A L, HALEY C S, BUYS N, TALLY M, ANDERSSON G, GEORGES M, ANDERSSON L. A regulatory mutation in IGF2 causes a major QTL effect on muscle growth in the pig, 2003, 425(6960): 832-836.

[30] GRAF B, SENN M. Behavioural and physiological responses of calves to dehorning by heat cauterization with or without local anaesthesia, 1999, 62(2): 153-171.

[31] LONG C R, GREGORY K E. Inheritance of the horned, scurred, and polled condition in cattle, 1978, 69(6): 395-400.

[32] MEDUGORAC I, SEICHTER D, GRAF A, RUSS I, BLUM H, G PEL K H, ROTHAMMER S, F RSTER M, KREBS S. Bovine polledness – An autosomal dominant trait with allelic heterogeneity, 2012, 7(6): e39477.

[33] TAN W F, CARLSON D F, LANCTO C A, GARBE J R, WEBSTER D A, HACKETT P B, FAHRENKRUG S C. Efficient nonmeiotic allele introgression in livestock using custom endonucleases, 2013, 110(41): 16526-16531.

[34] LYALL J, IRVINE R M, SHERMAN A, MCKINLEY T J, NUNEZ A, PURDIE A, OUTTRIM L, BROWN I H, ROLLESTON-SMITH G, SANG H, TILEY L. Suppression of avian influenza transmission in genetically modified chickens, 2011, 331(6014): 223-226.

[35] RUIZ-HERNANDEZ R, MWANGI W, PEROVAL M, SADEYEN J R, ASCOUGH S, BALKISSOON D, STAINES K, BOYD A, MCCAULEY J, SMITH A, BUTTER C. Host genetics determine susceptibility to avian influenza infection and transmission dynamics, 2016, 6: 26787.

[36] LEDFORD H,.. 2015.

[37] 王大元. 美國(guó)轉(zhuǎn)基因三文魚商業(yè)化的啟示科學(xué)通報(bào), 2016, 61(3): 289-295.

Wang D Y. Implications of US GMO salmon approved for commercial food use., 2016, 61(3):289-295. (in Chinese)

[38] WALTZ E. First genetically engineered salmon sold in Canada, 2017, 548: 148.

[39] LIN S, STAAHL B T, ALLA R K, DOUDNA J A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery, 2014, 3: e04766.

[40] MA Y, CHEN W, ZHANG X, YU L, DONG W, PAN S, GAO S, HUANG X, ZHANG L. Increasing the efficiency of CRISPR/Cas9- mediated precise genome editing in rats by inhibiting NHEJ and using Cas9 protein, 2016, 13(7): 605-612.

[41] YANG D, SCAVUZZO M A, CHMIELOWIEC J, SHARP R, BAJIC A, BOROWIAK M. Enrichment of G2/M cell cycle phase in human pluripotent stem cells enhances HDR-mediated gene repair with customizable endonucleases, 2016, 6: 21264.

[42] RICHARDSON C D, RAY G J, DEWITT M A, CURIE G L, CORN J E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA, 2016, 34(3): 339-344.

[43] HENDEL A, BAK R O, CLARK J T, KENNEDY A B, RYAN D E, ROY S, STEINFELD I, LUNSTAD B D, KAISER R J, WILKENS A B, BACCHETTA R, TSALENKO A, DELLINGER D, BRUHN L, PORTEUS M H. Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR- Cas genome editing in human primary cells, 2015, 33(9): 985-989.

[44] YU C, LIU Y, MA T, LIU K, XU S, ZHANG Y, LIU H, LA RUSSA M, XIE M, DING S, QI LEIS. Small molecules enhance CRISPR genome editing in pluripotent stem cells, 2015, 16(2): 142-147.

[45] NISHIDA K, ARAZOE T, YACHIE N, BANNO S, KAKIMOTO M, TABATA M, MOCHIZUKI M, MIYABE A, ARAKI M, HARA K Y, SHIMATANI Z, KONDO A. Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems, 2016. Doi:10.1126/Science.aaf8729.

[46] KOMOR A C, KIM Y B, PACKER M S, ZURIS J A, LIU D R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage, 2016, 533(7603): 420-424.

[47] PAN Y, SHEN N, JUNG-KLAWITTER S, BETZEN C, HOFFMANN G F, HOHEISEL J D, BLAU N. CRISPR RNA-guided FokI nucleases repair a PAH variant in a phenylketonuria model, 2016, 6: 35794.

[48] TERAO M, TAMANO M, HARA S, KATO T, KINOSHITA M, TAKADA S. Utilization of the CRISPR/Cas9 system for the efficient production of mutant mice using crRNA/tracrRNA with Cas9 nickase and FokI-dCas9, 2016, 65(3): 275-283.

[49] SLAYMAKER I M, GAO L, ZETSCHE B, SCOTT D A, YAN W X, ZHANG F. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity, 2015, 351(6268): 84.

[50] KLEINSTIVER B P, PATTANAYAK V, PREW M S, TSAI S Q, NGUYEN N T, ZHENG Z, JOUNG J K. High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects, 2016, 529: 490-495.

[51] FU Y, SANDER J D, REYON D, CASCIO V M, JOUNG J K. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs, 2014, 32(3): 279-284.

[52] CHO S W, KIM S, KIM Y, KWEON J, KIM H S, BAE S, KIM J S. Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA- guided endonucleases and nickases, 2014, 24(1): 132-141.

[53] HUANG S, WEIGEL D, BEACHY R N, LI J. A proposed regulatory framework for genome-edited crops, 2016, 48(2): 109-111.

[54] WALTZ E. Gene-edited CRISPR mushroom escapes US regulation, 2016, 532: 158-159.

[55] GAO C. The future of CRISPR technologies in agriculture, 2018. Doi:10.1038/nrm.2018.2

（責(zé)任編輯 林鑒非）

Breeding by Molecular Writing (BMW): the Future Development of Animal Breeding

LIU ZhiGuo1, WANG BingYuan1, MU Yulian1, WEI Hong2, CHEN JunHai3, LI Kui1

(1Institute of Animal Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193,2Army Medical University, Department of Laboratory Animal Science, College of Basic Medical Sciences, Chongqing 400038,3Shenzhen Jinxinnong Technology Co., LTD, Shenzhen 518106, Guangdong)

With the rapid development of genomics and genome editing techniques, and the extensive application of techniques such as microinjection and somatic cell nuclear transfer, a new set of breeding strategies and methods has gradually formed, which we named breeding by molecular writing (BMW). Using BMW, directional breeding of new varieties can be achieved by molecular-level genome editing, which can not only break down reproductive barriers separating different taxa, allowing the cross-species introduction of new traits, but also enable single-nucleotide insertion, deletion, and substitution in individual genomes. This can include the precise integration of exogenous genes; precise deletion and substitution of endogenous genes; and replication, deletion, and substitution of SNP loci. The main advantage of BMW is the rapid and efficient gathering of several beneficial traits into one species, while significantly reducing unintended effects. Molecular writing can be used for the following tasks: (1) identification and verification of new breeding markers; (2) cross-species molecular writing; (3) base sequence deletion in genomes; and (4) molecular writing within species. The BMW technique allows the introduction of only one or several target genes or SNPs and the rapid acquisition of new stable genetic varieties with pronounced target characters without sexual hybridization, and can then create new varieties in combination with conventional breeding methods. BMW can achieve genetic (or molecular) hybridization breeding at the individual and group levels, acquiring molecular heterosis, efficiently resolving several long-standing difficulties in breeding, and significantly improving breeding efficiency. It has strong potential for application in livestock and poultry breeding, and is a key part of the future of breeding. This paper discusses the basic concepts, research methods, research contents, and current research status of breeding by molecular writing in detail, and presents the prospects of applying BMW, providing references for researchers and practitioners in fields such as animal breeding and livestock and poultry reproduction.

breeding; breeding by molecular writing; gene editing; somatic cell nuclear transfer; gene knockout

2017-10-18；

2018-04-16

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)(2016ZX08006-001)、北京市自然科學(xué)基金(6173034)、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)院級(jí)統(tǒng)籌項(xiàng)目（Y2016JC07）

劉志國(guó)，Tel：18600463681；E-mail：liuzhiguo@caas.cn。

李奎，E-mail：likui@caas.cn