張玉娟，游均，劉愛麗，黎冬華，于景印，王燕燕，周瑢，宮慧慧，張秀榮

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芝麻發(fā)芽期耐鹽性鑒定方法研究及耐鹽候選基因的挖掘

張玉娟1，2，游均1，劉愛麗1，黎冬華1，于景印1，王燕燕1，周瑢1，宮慧慧2，張秀榮1

（1中國農業(yè)科學院油料作物研究所/農業(yè)部油料作物生物學與遺傳育種重點實驗室，武漢 430062；2山東棉花研究中心，濟南 250100）

【目的】確定芝麻發(fā)芽期耐鹽性鑒定適宜的NaCl脅迫濃度和評價指標，發(fā)掘耐鹽種質和耐鹽相關重要基因，為芝麻耐鹽性大規(guī)模鑒定、遺傳改良和耐鹽機理研究提供方法借鑒和優(yōu)異基因資源?！痉椒ā恳?份耐鹽性差異較大的芝麻種質為材料，在不同濃度的NaCl（0、50、100、150、200和250 mmol·L-1）脅迫下發(fā)芽，測定其發(fā)芽勢、成苗率、根長、芽長和鮮重等指標，通過對指標值的方差分析、主成分分析、隸屬函數(shù)和相關性分析等，篩選芝麻發(fā)芽期耐鹽性鑒定適宜的NaCl處理濃度和評價指標。以100 mmol·L-1NaCl溶液為處理濃度，相對成苗率為鑒定指標對71份芝麻核心種質進行發(fā)芽期耐鹽性鑒定和全基因組關聯(lián)分析，并對獲得的候選基因進行功能注釋；通過NaCl脅迫下芝麻幼苗葉片轉錄組測序和熒光定量PCR分析候選基因的表達模式，篩選耐鹽相關候選基因?！窘Y果】對不同濃度NaCl脅迫下8份芝麻材料發(fā)芽各指標進行統(tǒng)計和方差分析表明，100 mmol·L-1的NaCl處理下，除發(fā)芽勢外，發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、成苗率、根長、芽長和苗鮮重的標準偏差值均較大，所有指標在0.05水平上均存在顯著差異，100 mmol·L-1的 NaCl溶液可以作為芝麻發(fā)芽期耐鹽性鑒定的適宜脅迫濃度；相對成苗率、相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽指數(shù)、相對活力指數(shù)、相對芽長、相對根長和相對鮮重7個指標與芝麻發(fā)芽期耐鹽性關系密切，貢獻率較高，可以作為芝麻發(fā)芽期耐鹽性鑒定的評價指標。71份芝麻核心種質材料的相對成苗率變異比較豐富，符合正態(tài)分布；通過對71份芝麻核心種質相對成苗率與SNP標記進行全基因組關聯(lián)分析，檢測到7個與芝麻發(fā)芽期耐鹽性顯著關聯(lián)的SNP標記（LG5:688003、LG7:9582027、LG10:5274091、LG10:10788493、LG11:11924186、LG14:2128695和LG16:3930301），SNP標記上、下游各100 kb區(qū)間內共有基因67個，其中有功能注釋的基因34個；通過耐鹽材料S04在鹽脅迫下的轉錄組測序和熒光定量PCR對預測的候選基因進行表達模式分析，共有21個候選基因受到鹽脅迫誘導顯著差異表達。【結論】芝麻發(fā)芽期耐鹽性鑒定的適宜NaCl脅迫濃度為100 mmol·L-1，相對成苗率等7個指標可以作為適宜的評價指標；檢測到與芝麻發(fā)芽期耐鹽性顯著關聯(lián)的SNP標記7個，并鑒定出耐鹽候選基因21個。

芝麻；耐鹽性；全基因組關聯(lián)分析；耐鹽基因

0 引言

【研究意義】鹽堿化和次生鹽堿化土壤廣泛分布于世界各地，特別是沿海、內陸干旱和半干旱地區(qū)較為嚴重，土壤鹽堿化造成了作物生境條件的變化，影響其生長過程和干物質積累，重度鹽堿土壤甚至無法種植利用，嚴重制約農業(yè)生產的可持續(xù)發(fā)展[1]。當前，中國鹽堿地總面積約1×108hm2，主要分布在華北、西北和東北等內陸干旱地區(qū)及沿海地區(qū)，且面積逐年增加[2]。芝麻是中國五大油料作物之一，年消費量（約1.5×106t）和進口量（2016年達到9.3×105t）均居世界之首，但國內芝麻生產總供給不足50%。因此，加強西部和內陸干旱、半干旱地區(qū)次生鹽堿地和濱海土壤的開發(fā)利用，對擴大芝麻種植面積、提高自給率具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】國內外諸多學者對其他植物耐鹽性研究比較深入，建立了針對不同作物的耐鹽性鑒定方法，開展了大量的耐鹽作物種質資源評價工作，對多種作物如小麥、水稻、玉米、棉花等種質資源進行了耐鹽性鑒定篩選工作[3-6]。植物對鹽脅迫的響應、抵御機理是一個非常復雜的過程，包括鹽信號的轉導、特異轉錄因子的激活和下游應答基因的表達等[7]。迄今研究較清楚的鹽脅迫應答機制是SOS（salt overly sensitive）信號轉導途徑，包含6個關鍵基因，在鹽脅迫下通過不同的作用方式調控植物對鹽脅迫的抵御[8]。通過QTL定位和全基因組關聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS）挖掘耐鹽基因應用較多。Xu等[9]以小麥耐鹽重組自交系群體為材料，定位到11個與耐鹽性顯著關聯(lián)的QTL位點；Yu等[10]對198份苜蓿地方品種進行了GWAS分析，發(fā)現(xiàn)了23個與耐鹽性顯著關聯(lián)的SNP位點，獲得2個耐鹽基因；Thudi等[11]對鹽脅迫下擬南芥群體進行耐鹽相關性狀的連鎖分析和GWAS分析，獲得4個耐鹽關鍵基因；、、、和等耐鹽基因先后被驗證了其提高耐鹽性的功能[12-16]?！颈狙芯壳腥朦c】目前，芝麻耐鹽性研究嚴重滯后于小麥、玉米、棉花等其他作物[17-19]，缺乏完善的耐鹽性鑒定方法，分子基礎研究極其薄弱，基本處于空白，可用的耐鹽基因資源未見報道，制約著芝麻耐鹽育種的發(fā)展。【擬解決的關鍵問題】種子發(fā)芽期不僅是植物生長發(fā)育過程中最關鍵的一個生長階段，有研究表明在鹽脅迫逆境環(huán)境下，種子發(fā)芽期的耐鹽性最敏感，隨著植物的生長，其耐鹽性逐漸提高[20-21]。本研究以芝麻核心種質為研究材料，篩選芝麻發(fā)芽期耐鹽性鑒定適宜的NaCl處理濃度和評價指標，發(fā)掘耐鹽優(yōu)異種質和相關重要基因，為芝麻耐鹽性大規(guī)模鑒定發(fā)掘和耐鹽育種提供方法和基因資源支持。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2017年在中國農業(yè)科學院油料作物研究所芝麻種質資源培養(yǎng)間進行。供試芝麻核心種質材料共71份，包括53份國內種質（來自吉林、新疆和福建等18個省份）和18份國外種質（來自美國、日本和印度等10個國家），由中國農業(yè)科學院油料作物研究所芝麻種質中期庫提供。

1.2 種子發(fā)芽期的適宜脅迫濃度和評價指標

1.2.1 NaCl脅迫適宜濃度的確定 挑選耐鹽性差異較大的種質材料8份，設置0（對照，去離子水）、50、100、150、200和250 mmol·L-1的NaCl溶液，共6個處理，每處理重復3次，每重復用種50粒；將2%次氯酸鈉消毒后的種子均勻放在鋪有2層濾紙、直徑為10 cm、高7 cm的塑料培養(yǎng)皿中，加入NaCl溶液15 mL，置于28℃、濕度60%的培養(yǎng)箱內黑暗發(fā)芽。第2天開始記錄每皿的發(fā)芽種子數(shù)（發(fā)芽的標準為胚根長度≥種子長度），第6天調查統(tǒng)計幼苗根長、芽長、鮮重和正常苗數(shù)；計算各材料發(fā)芽勢、成苗率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、根長、芽長和鮮重的均值。

正常苗判定標準：各器官生長良好、勻稱、健康的幼苗；帶有輕微缺陷的幼苗（某一器官生長稍遲緩，但其他與健康幼苗相近）；輕微感染的幼苗（由真菌或細菌感染導致幼苗發(fā)病腐爛，但被感染前各器官生長基本正常[22]。

各指標按以下公式計算：

發(fā)芽勢（%）=（第3天發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)）×100；

成苗率（%）=（第6天正常苗數(shù)/供試種子數(shù)）×100；

發(fā)芽指數(shù)=∑（Gt/Dt），Gt表示時間t的發(fā)芽數(shù)，Dt表示對應的發(fā)芽日數(shù)；

活力指數(shù)=發(fā)芽指數(shù)×鮮重；

指標相對值=處理平均測定值/對照平均測定值。

1.2.2 測定數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和適宜評價指標的確定 利用Excel2010對數(shù)據(jù)進行整理統(tǒng)計計算，利用SAS9.1軟件對測定指標數(shù)據(jù)進行方差分析、主成分分析和相關性分析。耐鹽性綜合評價采用隸屬函數(shù)法[23]。

公式（1）中計算每一個材料各綜合指標的隸屬函數(shù)值，X表示第個綜合指標的測定值；Xmin、Xmax分表表示第個綜合指標的最小值和最大值。公式（2）計算綜合指標的權重，代表各材料第個綜合指標的貢獻率。公式（3）計算各材料的耐鹽性綜合評價值。

1.3 全基因組關聯(lián)分析及耐鹽候選基因的預測

調查71份核心種質群體在適宜濃度NaCl處理后的相對成苗率表型數(shù)據(jù)，基于本課題組前期芝麻核心種質全基因組重測序獲得的SNP[24]，利用TASSEL 5.0軟件[25]，采用混合線性模型進行關聯(lián)分析，并利用qqMan繪制曼哈頓圖；顯著關聯(lián)SNP寬松閾值設為-lg（）=3，嚴謹閾值設為-lg（）= 4.5；在顯著關聯(lián)的SNP位點上下游各100 kb的序列作為候選區(qū)間，對區(qū)間內候選基因進行功能注釋。

1.4 耐鹽候選基因表達分析

取一份耐鹽材料（S04），用1/2 Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)至第一對真葉展開時，用150 mmol·L-1NaCl營養(yǎng)液處理幼苗根部，分別于處理0（CK）、6、12和24 h各取10株幼苗葉片混合后用于轉錄組測序分析和熒光定量PCR（qRT-PCR）分析。轉錄組測序分析由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成，顯著差異基因篩選的閾值為|log2FoldChange(處理/對照)|≥1。采用天根RNA提取試劑盒提取樣品總RNA，反轉錄利用HiScriptⅡ 1st Strand cDNA Synthesis kit（諾唯贊，南京）試劑盒，利用ChamQTM SYBR?qPCR Master Mix試劑（諾唯贊，南京）在羅氏LightCycler480系統(tǒng)上進行qRT-PCR。內參基因為Histone H3.3 (LOC105176435)[26]，引物設計利用Primer 5軟件（表1）。

2 結果

2.1 芝麻發(fā)芽期耐鹽性鑒定適宜NaCl濃度的確定

在不同濃度的NaCl脅迫下，8份芝麻種質材料的發(fā)芽均受到不同程度的影響（圖1，圖2），在50 mmol·L-1的NaCl脅迫下，發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)與對照相比均未出現(xiàn)明顯變化，成苗率和芽長略有下降，而5份材料的根長和6份材料的鮮重卻略有升高，說明低濃度的NaCl脅迫對某些材料的幼苗生長有一定促進作用。在100 mmol·L-1的NaCl脅迫下，7份材料的發(fā)芽勢與對照相比未出現(xiàn)明顯變化，僅S38顯著下降，所有材料的成苗率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、根長、芽長和鮮重與對照相比均出現(xiàn)顯著下降。當NaCl濃度升高到150 mmol·L-1，所有材料的發(fā)芽均受到明顯抑制，各發(fā)芽指標值均顯著下降；多數(shù)材料的胚根雖然能夠萌動，但發(fā)芽后期多為畸形、壞死、子葉不能正常伸展等等。在200和250 mmol·L-1NaCl脅迫下，多數(shù)材料不能萌動。

表1 候選基因的引物序列

對不同濃度NaCl脅迫下8份芝麻材料發(fā)芽各指標進行統(tǒng)計和方差分析表明（表2）：50 mmol·L-1的NaCl處理與對照相比，發(fā)芽勢、根長和鮮重均無顯著差異，說明鹽脅迫程度較輕；100 mmol·L-1的NaCl處理下，除發(fā)芽勢外，發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、成苗率、根長、芽長和苗鮮重的標準偏差值均較大，所有指標在0.05水平上均存在顯著差異，說明這些指標在8份芝麻材料間分散程度均較大：150、200和250 mmol·L-1的NaCl處理下，發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、成苗率、根長、芽長和苗鮮重與對照相比均差異顯著，但大多數(shù)種質材料的絕大多數(shù)種子不能成長為正常苗（圖1，圖2），說明鹽脅迫程度過重。因此，100 mmol·L-1的NaCl可以作為芝麻發(fā)芽期耐鹽性鑒定的適宜處理濃度。

圖2 不同濃度NaCl脅迫下耐鹽（S04）和敏感（S38）芝麻種質材料發(fā)芽第6天的表現(xiàn)

表2 不同濃度NaCl脅迫下8份芝麻材料發(fā)芽各指標的統(tǒng)計分析

同一列不同字母表示在=0.05水平差異顯著

Different letters in the same column for each variable indicates a significant difference at 0.05 level

2.2 芝麻發(fā)芽期耐鹽性鑒定適宜評價指標的篩選

對100 mmol·L-1的NaCl脅迫下芝麻發(fā)芽各指標的相對值進行統(tǒng)計分析、相關性分析、主成分分析和隸屬函數(shù)分析。8份芝麻材料的各發(fā)芽指標差異明顯，其中相對成苗率變化幅度最大，為28.97%—88.63%，標準偏差值也最大，表明該指標在各材料間分散程度最大（表3）。相關性分析表明（表4），各指標間均存在一定的相關性，其中相對鮮重、相對活力指數(shù)、相對芽長和相對成苗率之間的相關性在0.05水平上極顯著，相關系數(shù)分別為0.815*、0.787*和0.759*。主成分分析結果顯示（表5），第一主成分貢獻率為76.920%，第二主成分貢獻率為9.984%，前2個主成分的累計貢獻率達到86.904%，包含了原始指標的絕大部分信息。第一主成分主要包括相對活力指數(shù)、相對芽長、相對發(fā)芽指數(shù)和相對發(fā)芽勢，第二主成分主要包括相對根長、相對鮮重和相對成苗率，表明這7個指標均能反映芝麻的耐鹽性。

表3 100 mmol·L-1的NaCl處理條件下芝麻發(fā)芽期各指標的統(tǒng)計分析

表4 100 mmol·L-1的NaCl處理條件下芝麻發(fā)芽期各指標的相關性分析

** 在0.01水平差異極顯著；*在0.05水平差異顯著

** indicates a significant relationship at 0.01 level; * indicates a significant relationship at 0.05 level

表5 2個綜合指標的特征值、貢獻率及特征向量

基于前2個主成分的綜合指標值，采用隸屬函數(shù)法綜合評價8份芝麻種質材料的耐鹽性。先根據(jù)公式（1）獲得各材料所有綜合指標的隸屬函數(shù)值，通過公式（2）計算出各綜合指標的權重，再根據(jù)公式（3）計算出各材料在100 mmol·L-1NaCl脅迫下耐鹽性綜合評價D值（表6）。D值越大，材料的綜合耐鹽性越強，從中評選出2份高耐鹽種質S11和S10，其D值分別為0.991和0.907，S04種質耐鹽性較強，D值為0.721。相關性分析顯示D值與7個耐鹽鑒定指標間均呈顯著正相關（表4），表明這7個指標能較好的區(qū)分芝麻不同種質的耐鹽性差異。

表6 各材料綜合指標值、權重、μ(x)值和D值

2.3 芝麻核心種質群體全基因組關聯(lián)分析及耐鹽候選基因的預測

對71份（含以上8份）芝麻核心種質在100 mmol·L-1NaCl脅迫下發(fā)芽期的相對成苗率調查記載，數(shù)值范圍為16.67%—88.26%，平均值為51.04%，變異系數(shù)為30.08。當樣本數(shù)量n＞50時，參考國家標準GB4882-85進行正態(tài)檢驗，D檢驗結果為0.0785（大于0.05），符合正態(tài)分布，且在各個等級均有分布，耐鹽性變異比較豐富（圖3），該群體適合做耐鹽性全基因組關聯(lián)分析。

71份核心種質相對成苗率與SNP標記進行GWAS分析，共檢測到7個與相對成苗率顯著關聯(lián)的SNP標記（LG5:688003、LG7:9582027、LG10:5274091、LG10:10788493、LG11:11924186、LG14:2128695和LG16:3930301），分別位于LG5、LG7、LG10、LG11、LG14和LG16連鎖群上（圖4），SNP標記上、下游各100 kb區(qū)間內共有基因67個，其中有功能注釋的基因34個，包含了7個參與植物非生物逆境脅迫應答的基因，如甲基轉移酶（LOC105171975和LOC105171977）、尿苷二磷酸葡萄糖基轉移酶（LOC105172099）、紅素氧還蛋白（LOC105176797）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶（LOC105176801）和富亮氨酸重復類受體蛋白激酶（LOC105176803）等基因，涉及多種生物學功能。候選基因中還包含了5個去甲烏藥堿合成酶類似蛋白基因和4個去甲烏藥堿合成酶2類似蛋白基因，均位于第7連鎖群，其中LOC105166829、LOC105166830、LOC105166831和LOC105166832、LOC105166836和LOC105166837為兩組串聯(lián)重復基因。

圖3 核心種質群體相對成苗率正態(tài)分布圖

圖4 鹽脅迫下芝麻發(fā)芽期相對成苗率全基因組關聯(lián)分析的曼哈頓圖

2.4 耐鹽候選基因的表達分析

利用耐鹽材料S04在鹽脅迫下的轉錄組結果（未發(fā)表數(shù)據(jù)）對以上預測的34個候選基因進行表達模式分析，其中21個候選基因在芝麻葉片中受到鹽脅迫誘導顯著差異表達（圖5，表7），有12個基因在鹽脅迫24與0 h相比表達量顯著下降，9個基因顯著上調表達，基因LOC105172100和LOC105166820分別編碼了多聚半乳糖醛酸酶和ATP酶，在NaCl脅迫6、12和24 h均顯著上調表達，基因LOC105166829、LOC105172096、LOC105166932、LOC105166836、LOC105166833、LOC105166827和LOC105176796在NaCl脅迫6或12 h顯著上調表達（圖5）。

從21個候選基因中隨機選取8個基因進行qRT- PCR分析，結果顯示，LOC105166820、LOC105166829、LOC105166932和LOC105172100在NaCl脅迫后6—24 h上調表達，LOC105172099、LOC105176797、LOC105176803和LOC105166823在NaCl脅迫后下調表達（圖6），表達量變化趨勢與轉錄組分析結果一致。

3 討論

發(fā)芽期耐鹽性鑒定快速、簡便、高效，適用于資源和育種群體的大規(guī)模評價篩選，已被廣泛應用于其他作物。目前，國內小麥種質資源芽期耐鹽性鑒定參考農業(yè)部行業(yè)標準《小麥耐鹽性鑒定評價技術規(guī)范》NY/PZT001-2002進行，該標準以350 mmol·L-1NaCl為篩選濃度，以相對鹽害率為鑒定指標；《棉花耐鹽性鑒定評價技術規(guī)范》DB13T1339-2010規(guī)定了棉花發(fā)芽期耐鹽性鑒定方法，該方法以0.5%的NaCl或0.4%的地下咸水為鹽脅迫濃度，以相對鹽害率作為評價指標；水稻和玉米種質芽期耐鹽性鑒定目前在國內尚未有統(tǒng)一標準，田蕾等[4]利用125 mmol·L-1NaCl溶液對64份粳稻種質資源耐鹽性進行鑒定評價，相對鹽害率、發(fā)芽指數(shù)和相對根長可以作為粳稻芽期耐鹽性快速鑒定的重要指標；張海艷等[5]以220和270 mmol·L-1的NaCl兩種脅迫濃度對47份玉米品種進行發(fā)芽期耐鹽性綜合評價，認為發(fā)芽率在所有玉米發(fā)芽期鑒定指標中與耐鹽性關系最密切，在品種間的表現(xiàn)也最穩(wěn)定。本研究篩選的芝麻發(fā)芽期耐鹽性鑒定以100 mmol·L-1NaCl為適宜脅迫濃度，與以上介紹的幾種作物均不同，可能與不同作物對鹽脅迫的耐受能力不同有關；本研究發(fā)現(xiàn)相對活力指數(shù)、相對芽長、相對發(fā)芽指數(shù)、相對發(fā)芽勢、相對根長、相對鮮重和相對成苗率與耐鹽性關系均較為密切，與報道的其他作物類似，當然，各指標的貢獻率存在一定差異，表明芝麻耐鹽性是一個較復雜的性狀，為研究制訂綜合評價方法或標準奠定基礎。

圖5 NaCl脅迫下21個候選基因的差異表達模式

表7 芝麻耐鹽性顯著相關的SNP位點和耐鹽候選基因

圖6 NaCl脅迫后8個耐鹽候選基因的表達模式

本研究在前期芝麻核心種質全基因組重測序[24]的基礎上，利用GWAS方法，獲得了7個與耐鹽性顯著關聯(lián)的SNP標記，可優(yōu)先選擇貢獻率較大的標記，進一步驗證后開發(fā)耐鹽分子標記，用于芝麻耐鹽品種的遺傳改良。本研究挖掘到21個與芝麻耐鹽性有關的重要候選基因，其中，SNP 5274091候選區(qū)間的候選基因LOC105172100位于10號連鎖群，編碼一個多聚半乳糖醛酸酶（PG），該酶是植物最大的水解酶家族之一，已被證實其參與植物非生物逆境脅迫的響應過程之中[27-29]。Orozcocárdenas等[28]研究發(fā)現(xiàn)基因在逆境脅迫下大量上調表達，PG催化的水解反應中間產物寡聚半乳糖醛酸可以快速觸發(fā)H2O2反應，H2O2作為第二信使參與到植物的防御反應。寇曉虹[29]利用NaCl脅迫處理番茄幼苗和綠熟期的果實組織圓片，發(fā)現(xiàn)在NaCl處理1 h后顯著上調表達，認為很有可能作為一個早期的信號基因參與NaCl引起的脅迫反應，并利用產物激發(fā)子傳遞信號，激發(fā)植物防衛(wèi)反應信號途徑中一系列基因的表達。本研究中LOC105172100在芝麻幼苗葉片中受鹽脅迫快速顯著上調表達，提示其可能以類似的方式參與到芝麻鹽脅迫初期防御系統(tǒng)。

在本研究中，候選基因LOC105172099編碼了一種尿苷二磷酸葡萄糖基轉移酶（UDP-glycosyltransferase，UGT），UGT被發(fā)現(xiàn)可能通過調節(jié)次級代謝產物和體內激素平衡而參與植物的非生物逆境脅迫抵御過程[30-31]，芝麻幼苗葉片中LOC105172099基因在鹽脅迫下顯著下調表達，說明它很可能以負調控方式參與到芝麻鹽脅迫調控過程。研究表明紅素氧還蛋白基因在植物抵御非生物脅迫方面發(fā)揮著重要的作用[32-33]，Li等[34]研究發(fā)現(xiàn)紅素氧還類似蛋白基因可以通過調節(jié)植物體內離子平衡和清除體內活性氧來提高擬南芥對NaCl脅迫的抵御，本研究篩選到一個紅素氧還蛋白基因LOC105176797，位于第14連鎖群，該基因很可能在芝麻抵御NaCl脅迫過程中也起到類似的作用。這些候選基因的發(fā)現(xiàn)，對芝麻耐鹽定向育種具有重要的意義。除此之外，SNP 9582027候選區(qū)間LOC105166829、LOC105166830、LOC105166831和LOC105166832為一組串聯(lián)重復基因，均編碼一種去甲烏藥堿合成酶（NCS）類似蛋白，NCS是芐基異喹啉類生物堿合成代謝途徑初始反應步驟的關鍵酶[35]，目前，尚未有研究發(fā)現(xiàn)其參與植物的逆境脅迫響應過程，但基因表達模式分析顯示這些基因很可能與芝麻鹽脅迫響應機制有關，有待進一步驗證?？傊?，本研究鑒定得到的與芝麻耐鹽性相關的SNP位點和候選基因為后續(xù)開展芝麻大規(guī)模耐鹽等位基因發(fā)掘、耐鹽基因驗證和功能標記開發(fā)等相關研究奠定重要的工作基礎。

4 結論

確定了100 mmol·L-1NaCl為芝麻發(fā)芽期耐鹽性鑒定的適宜濃度，相對成苗率等7個指標與芝麻耐鹽性關系密切。71份芝麻核心種質材料的耐鹽性數(shù)值變異比較豐富，符合正態(tài)分布，共檢測到與芝麻發(fā)芽期耐鹽性顯著關聯(lián)的SNP位點7個，連鎖不平衡區(qū)域包含候選基因67個，基因功能注釋和鹽脅迫表達分析獲得耐鹽候選基因21個。

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（責任編輯 李莉）

Screening Method for Salt Tolerance in Sesame (L.) and Identification of Candidate Salt-tolerant Genes

ZHANG YuJuan1,2, YOU Jun1, LIU AiLi1, LI DongHua1, YU JingYin1, WANG YanYan1, ZHOU Rong1, GONG HuiHui2, ZHANG XiuRong1

(1Oil Crops Research Institute of the Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Oil Crops, Ministry of Agriculture, Wuhan 430062;2Cotton Research Center, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100 )

【Objective】In order to evaluate salt tolerance of sesame germplasms and reveal the genetic basis of salt tolerance in sesame at the germination stage, optimum NaCl concentration and best salt tolerance indexes were determined, salt-tolerant sesame genotypes as well as candidate genes were identified in this study. 【Method】Eight sesame genotypes with different salt tolerance were germinated under different NaCl concentrations (0, 50, 100, 150, 200 and 250 mmol·L-1). Seven germination indexes including germination potential, germination index, vigor index, seedling rate, radicle length, embryo length and fresh weight of seedling were measured. The optimum NaCl concentration and salt tolerance indexes of sesame were determined using variance analysis, principal component analysis, membership function and correlation analysis based on the relative values of multiple indexes. In addition, genome-wide association analysis (GWAS) of salt tolerance related trait in 71 sesame germplasms was performed to find the SNP loci and candidate genes related to salt tolerance in sesame. Gene function annotation, transcriptome analyses and real-time quantitative reverse transcriptase PCR (qRT-PCR) were used to identify important candidate genes involved in salt tolerance. 【Result】The larger standard value deviations of germination indexes were observed at 100 mmol·L-1NaCl concentration, implying that 100 mmol·L-1is the optimum NaCl concentration for salt-tolerance screening in this study. The seven indexes were highly correlated with salt tolerance at germination stage, suggesting that, these indexes could be targeted for effective screening of salt-tolerance in large sesame germplasm. The genome-wide association analysis identified 7 SNP loci peaks (LG5:688003, LG7:9582027, LG10:5274091, LG10:10788493, LG11:11924186, LG14:2128695 and LG16:3930301) significantly associated with salt tolerance and 34 functional candidate genes. The transcriptome analysis and qRT-PCR showed that 21 candidate genes respond strongly to salt stress.【Conclusion】In this study, 100 mmol·L-1is the optimum NaCl concentration for salt-tolerance screening and seven indexes including relative seedling rate could be targeted for effective screening of salt-tolerance in large sesame germplasm. In addition, 7 SNP loci peaks significantly associated with salt tolerance were identified and 21 candidate salt-tolerant genes were discovered.

sesame; salt tolerance; genome-wide association study; salt-tolerant genes

2018-02-06；

2018-04-09

農業(yè)部油料作物生物學與遺傳育種重點實驗室開放課題（2017007）、國家特色油料產業(yè)技術體系（CARS-14）、中國農業(yè)科學院創(chuàng)新工程（CAAS-ASTIP-2013-OCRI）、農業(yè)部黃淮海棉花遺傳改良與栽培生理重點實驗室開放課題（2016KL03）、山東省農業(yè)科學院創(chuàng)新工程“棉花與特色經濟作物學科團隊建設”

張玉娟，E-mail：723949246@qq.com。

張秀榮，E-mail：zhangxr@oilcrops.cn