吳曉雯， 張華偉， 余 海， 彭 欣， 張永普

(1. 溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江溫州 325035；2. 浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所， 浙江溫州 325005；3.蒼南縣水產(chǎn)研究所，浙江蒼南 325802)

日本花棘石鱉(LiolophurajaponicaLischke)隸屬于軟體動(dòng)物門(Mollusca)，多板綱(Polyplacophora)，石鱉科(Chitonidae)，花棘石鱉屬，棲息于潮間帶中、低潮區(qū)，常附著于巖石上或石縫間。在中國(guó)東海、南海及朝鮮半島、日本均有分布。該種環(huán)帶肌肉肥厚，可食用，福建和海南等沿海居民常采捕食其肉，故有一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。日本花棘石鱉在浙江南部沿海的洞頭列島、北麂列島、大北列島、南麂列島、七星列島均為常見種[2-4]。多板綱軟體動(dòng)物的研究大多集中于形態(tài)特征[5- 6]、種類分布和群落結(jié)構(gòu)[1，7-8]、生活習(xí)性[9]、分類[10-14]以及齒舌的物理學(xué)特征[15]等方面。近年來(lái)，通過分子手段對(duì)石鱉的系統(tǒng)分類和進(jìn)化研究也有報(bào)道[16-17]，但未涉及石鱉的種群結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性等。

線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)具進(jìn)化速率較快，母性遺傳且基因重組率低等優(yōu)點(diǎn)，是研究種群遺傳結(jié)構(gòu)和進(jìn)化歷史的理想分子標(biāo)記[18-20]。mtDNA可以較好的揭示種內(nèi)和種間的變化[21]，其中細(xì)胞色素氧化酶亞基I(COⅠ)，基因變異較大、進(jìn)化速率較快，在軟體動(dòng)物腹足類[22]、雙殼類[23]、頭足類[24]等分子系統(tǒng)和種群遺傳結(jié)構(gòu)等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。16S rRNA基因在一級(jí)結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)上都相對(duì)保守，進(jìn)化速率比COⅠ基因慢，在種群研究中也有一定的應(yīng)用[25]。

本研究以浙江南部沿海的洞頭列島(洞頭島、大竹峙島、東策島、南爿山島、鹿西島、大瞿島)，北麂列島(北麂島)，大北列島(北龍山)，南麂列島(南麂島、后麂山島、大檑山嶼、柴峙島)和七星列島(東星仔島)巖相潮間帶的13個(gè)日本花棘石鱉自然群體為研究對(duì)象，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，旨在探討該種的種群結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性、遺傳背景等特征，推測(cè)不同自然群體的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，為其資源保護(hù)和遺傳學(xué)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本研究所用的樣品于2017年采自浙南沿海的洞頭列島(洞頭島、大竹峙島、東策島、南爿山島、鹿西島、大瞿島)，北麂列島(北麂島)，大北列島(北龍山)，南麂列島(南麂島、后麂山島、大檑山嶼、柴峙島)和七星列島(東星仔島)的巖相潮間帶(圖1，表1)，采集個(gè)體足部肌肉并標(biāo)記分裝后，置于液氮中帶回實(shí)驗(yàn)室后-80 ℃保存。

圖1 日本花棘石鱉采樣點(diǎn)分布圖Fig.1 Map of sampling sites of L. japonica

區(qū)域Region群體Population縮寫Abbreviation東經(jīng)East longitude北緯North latitude樣本數(shù)Sample size洞頭列島洞頭島DT121°10'19.13″27°49'57.44″13 大竹峙島 DZS121°12'48.74″27°49'12.87″13 東策島DC121°09'01.38″27°45'32.04″13 南爿山島 NPS121°15'33.62″28°00'15.29″10 大瞿島DQ121°05'23.97″27°47'29.92″10 鹿西島LX121°12'50.70″27°59'33.43″5北麂列島北麂島BJ121°11'47.82″27°37'08.82″13大北列島北龍山BL120°58'51.56″27°40'08.56″12南麂列島南麂島NJ121°03'06.28″27°27'30.57″3 后麂山島 HJS121°07'40.71″27°28'26.96″6 大檑山嶼 DLS121°05'24.50″27°29'39.48″8 柴峙島CS121°04'54.45″27°25'40.36″8七星列島東星仔島DX120°02'47.98″27°02'40.36″11

1.2 DNA提取

取足部肌肉，用雙蒸水洗去雜物，再用濾紙吸干，按照全式金EasyPure Marine Animal Genomic DNA Kit試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)步驟提取總DNA，于-20 ℃分管保存。

1.3 PCR擴(kuò)增和測(cè)序

實(shí)驗(yàn)使用無(wú)脊椎動(dòng)物COⅠ通用引物[26]擴(kuò)增：LCOⅠ1490(5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′)和 HCOⅠ 2198(5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′)，16SA(5′-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3′)和16SB(5′-CCGGTCTGAACTCAGATCATGT-3′)[27]，引物由上海生工(Sangon biotech)生物有限公司合成。

PCR反應(yīng)為25 μL體系，其中包括：超純水9.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL， 2×EasyTaq PCR SuperMix(+dye)(北京全式金生物技術(shù)有限公司)12.5 μL。PCR程序設(shè)置：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，51～53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min(變性延伸35個(gè)循環(huán))，最后72 ℃再延伸10 min。每次反應(yīng)均設(shè)置陰性對(duì)照以檢驗(yàn)是否有污染。PCR產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確定PCR產(chǎn)物為目的條帶后，送至上海生工生物有限公司進(jìn)行純化及雙向測(cè)序，以確保序列可靠性。

1.4 序列比對(duì)與分析

所得序列用DNAstar 5.0軟件包中的Seqman軟件處理，結(jié)合峰圖進(jìn)行人工校對(duì)，確保每一個(gè)位點(diǎn)準(zhǔn)確。將兩組數(shù)據(jù)(COⅠ和16S rRNA)通過NCBI的Blast比對(duì)分析，驗(yàn)證所得的序列均為目的基因。利用MEGA 6.0[28]中無(wú)脊椎動(dòng)物線粒體遺傳密碼子把所有的COⅠ編碼基因序列翻譯成氨基酸，以確認(rèn)此蛋白編碼基因片段是否正常翻譯。在所有序列中未發(fā)現(xiàn)終止密碼子，可確認(rèn)獲得的序列是線粒體而不是核假基因拷貝[29]。

利用DNAsp 5.0[30]分析多態(tài)位點(diǎn)數(shù)(Singleton polymorphic sites)，單倍型多樣性(Haplotype diversity，Hd)和核苷酸多樣性(Nucleotide diversity，Pi)，統(tǒng)計(jì)單倍型。利用MEGA 6.0分析堿基組成，計(jì)算保守位點(diǎn)(Conserved sites)、變異位點(diǎn)數(shù)(Variable sites)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)數(shù)(Parsim-information sites)、單突變位點(diǎn)(Singleton sites)，根據(jù)Kimura兩參數(shù)模型(Kimura-2-Parameter，K2P)[31]計(jì)算群體間的遺傳距離以及單倍型遺傳距離。采用最大擬然法(Maximum Likehood，ML法)[28]和貝葉斯法(Bayesian Inference，BI法)[32]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，進(jìn)行1 000次自檢。此外，利用Network 5.0[33]中Median-network法構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖，來(lái)探討日本花棘石鱉的單倍型譜系關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿基組成

本研究分析的125條日本花棘石鱉COⅠ基因片段經(jīng)比對(duì)最終獲得的長(zhǎng)度為675 bp。由表2可知，A+T(62.5%)含量明顯大于C+G(37.5%)含量，存在明顯的A或T堿基偏向，符合線粒體組成特征。共有保守位點(diǎn)634個(gè)，變異位點(diǎn)41個(gè)，其中包括簡(jiǎn)約信息點(diǎn)22個(gè)，單突變位點(diǎn)19個(gè)。

125條日本花棘石鱉16S rRNA基因片段經(jīng)比對(duì)長(zhǎng)度為517 bp，由表2可知，A+T (64.9%)含量明顯大于C+G(35.1%)含量，符合線粒體組成特征。共有保守位點(diǎn)508個(gè)，變異位點(diǎn)9個(gè)，其中簡(jiǎn)約信息點(diǎn)4個(gè)，單突變位點(diǎn)5個(gè)。

2.2 序列多態(tài)性分析

13個(gè)群體總體的COⅠ基因片段多態(tài)位點(diǎn)有41個(gè)，核苷酸多樣度指數(shù)(Pi)為0.006 01±0.000 57，單倍型多樣度指數(shù)(Hd)為0.847±0.025，平均核苷酸差異度為4.057 8。由表3可知，各群體間單倍型多樣度在0.756(南爿山島)～1.000(南麂島、柴峙島)之間，核苷酸多樣度在0.003 0(大檑山嶼)～0.014 8(南麂島)之間，平均核苷酸差異數(shù)在2.036(大檑山嶼)～10.000(南麂島)之間。南麂島群體的核苷酸多樣度、單倍型多樣度相對(duì)較高，而大檑山嶼和南麂島的核苷酸多樣度、單倍型多樣度都相對(duì)較低。

注：DT-洞頭島、DZS-大竹峙島、DC-東策島、NPS-南爿山島、DQ-大瞿島、LX-鹿西島、 BJ-北麂島、NJ-南麂島、HJS-后麂山島、BL-北龍山、DLS-大檑山嶼、CS-柴峙島、DX-東星仔島。以下類同

Note: DT-Dongtou Island, DZS-Dazhushi Island, DC-Dongce Island, NPS-Nanpanshan Island, DQ-Daqu Island, LX-Luxi Island, BJ-Beiji Island, NJ-Nanji Island, HJS-Houjishan Island, BL-Beilongshan Island, DLS-Daleishan Island, CS-Chaishi Island, DX-Dongxizai Island. The same as following

13個(gè)群體總體的16S rRNA基因片段多態(tài)位點(diǎn)有9個(gè)，核苷酸多樣度指數(shù)(Pi)為0.001 69 ± 0.003 24，單倍型多樣度為指數(shù)(Hd)為0.665±0.029，平均核苷酸差異度為0.871 2。由表4可知，各群體間單倍型多樣度在0.536(大檑山嶼)～0.987(南麂島)之間，核苷酸多樣度在0.001 0(大檑山嶼)～0.002 9(后麂山島)，平均核苷酸差異數(shù)在0.536(大檑山嶼)～1.533(后麂山島)之間。后麂山島群體的核苷酸多樣度最高，大檑山嶼群體的核苷酸多樣度最低；南麂島群體的單倍型多樣度最高，大檑山嶼群體單倍型多樣度最低。

此外，COⅠ基因片段共檢測(cè)到41個(gè)變異位點(diǎn)，定義了30個(gè)單倍型(Hap1～30)(表5)，其中，21個(gè)單倍型僅在單個(gè)群體一個(gè)個(gè)體中檢測(cè)到，Hap17在東策島群體的兩個(gè)個(gè)體中檢測(cè)到；Hap6是主體單倍型，基因序列表達(dá)為Hap6的個(gè)體占總個(gè)體數(shù)的34.1%，Hap5和Hap1各占總個(gè)體數(shù)的12.0%和11.2%。說明各群體內(nèi)具有豐富的多態(tài)性，但單倍型共享率不高。

表5 各群體間 COⅠ基因片段單倍型分布情況Tab.5 Distribution of haplotypes of COⅠ gene fragments among 13 populations of L. japonica

16S rRNA基因片段共檢測(cè)到9個(gè)變異位點(diǎn)，定義了10個(gè)單倍型(表6)，其中，Hap1為所有群體共有，基因序列表達(dá)為Hap1的個(gè)體占總個(gè)體數(shù)的48%。Hap2占總個(gè)體數(shù)的31.2%，Hap3占總個(gè)體數(shù)的9.6%。Hap4、Hap5、Hap9、Hap10為單個(gè)群體所擁有。

2.3 遺傳距離分析

13個(gè)群體間基于COⅠ基因片段的群體內(nèi)遺傳距離見表3，基于16S rRNA基因片段的遺傳距離見表4；13個(gè)群體間的遺傳距離見表7?；贑OⅠ基因片段分析，13個(gè)日本花棘石鱉群體間遺傳距離在0.003 1(大檑山嶼-北麂島，大檑山嶼-南爿山島)～0.011 0(大檑山嶼-柴峙島)，群體內(nèi)遺傳距離在0.003 4(大檑山嶼)～0.015 0(南麂島)；基于16S rRNA基因片段分析，群體間遺傳距離在0.001 1(南麂島-柴峙島)～0.002 5(后麂山島-柴峙島)，群體內(nèi)遺傳距離在0.001 0(大檑山嶼)～0.003 0(后麂山島)。日本花棘石鱉不同群體內(nèi)和群體間的遺傳距離處于同一水平，說明群體間遺傳分化程度低。

表6 各群體間16S rRNA基因片段單倍型分布情況Tab.6 Distribution of haplotypes of 16S rRNA gene fragment among 13 populations of L. japonica

表7 基于 COⅠ和16S rRNA片段的13個(gè)種群間遺傳距離Tab.7 Genetic distances of COⅠ gene and 16S rRNA fragments among 13 populations of L. japonica

注：對(duì)角線下方為COⅠ遺傳距離，對(duì)角線上方為16S rRNA遺傳距離

Note: Genetic distances ofCOⅠ genes are below the diagonal, genetic distances of 16S rRNA are above the diagonal

2.4 系統(tǒng)發(fā)生分析

以Acanthopleurabrevispinosa(COⅠ:KX537628.1；16S: KX537613.1)和A.granulata(COⅠ: AY377719.1；16S: AY377608.1)為外群，以K-2-P為模型構(gòu)建單倍型ML樹，使用Modeltest 3.7選出最優(yōu)模型構(gòu)建單倍型 BI樹。基于COⅠ基因的30個(gè)單倍型構(gòu)建的ML樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(圖2)和BI樹(圖3)相吻合，日本花棘石鱉群體內(nèi)Hap13、Hap15和Hap20聚合在一起，其它單倍型先后聚合一支，主要存在兩個(gè)明顯的單倍型類群，最后和外群類聚一起；基于16S rRNA基因的10個(gè)單倍型構(gòu)建的ML樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(圖4)與BI樹(圖5)相吻合顯示，10個(gè)單倍型先類聚為一支，再與外群聚合。部分單倍型置信值較低(置信值低于50%)，且13個(gè)不同地理群體單倍型散亂分布，沒有出現(xiàn)明顯的地理結(jié)構(gòu)和遺傳譜系結(jié)構(gòu)。

利用中介網(wǎng)絡(luò)鄰接法構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖，COⅠ基因網(wǎng)絡(luò)圖如圖6，顯示4個(gè)單倍型譜系分支，與ML系統(tǒng)樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相吻合。主要的單倍型為Hap1，Hap2和Hap6。其它單倍型通過一步或者多步突變分別于主要的相連。其中，Hap1突變?yōu)镠ap5和Hap24，出現(xiàn)一個(gè)過渡單倍型，但在此研究中未檢測(cè)到，可能與樣本數(shù)量有關(guān)。16S rRNA基因片段的網(wǎng)絡(luò)鄰接法構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖(圖7)，比較單一。

圖2 基于COⅠ基因13個(gè)群體日本花棘石鱉30個(gè)單倍型的ML系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 ML phylogenetic trees based on COⅠ gene fragments among 13 populations of L. japonica

圖3 基于COⅠ基因13個(gè)群體日本花棘石鱉30個(gè)單倍型的BI系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 BI phylogenetic trees based on COⅠ gene fragments among 13 populations of L.japonica

圖4 基于16S rRNA基因13個(gè)群體日本花棘石鱉單倍型的ML系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 ML phylogenetic trees based on 16S rRNA gene fragments among 13 populations of L. japonica

圖5 基于16S rRNA基因13個(gè)群體日本花棘石鱉單倍型的BI系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 BI phylogenetic trees based on 16S rRNA gene fragments among 13 populations of L. japonica

圖6 基于日本花棘石鱉COⅠ基因片段的Median-network網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 Median-network showing phylogenetic relationships among haplotypes based on COⅠ gene of L. japonica注：黃色圓圈表示某一具體單倍型，紅色圓圈表示缺失單倍型；紅色數(shù)字反應(yīng)兩兩單倍型之間的變異位點(diǎn)Note: Yellow circle represents unique haplotypes, red circle represents a deletion of haplotypes, and the red number represents mutation steps

圖7 基于日本花棘石鱉16S rRNA基因片段的Median-network網(wǎng)絡(luò)圖Fig.7 Median-network showing phylogenetic relationships among haplotypes based on 16S rRNA gene of L. japonica注：黃色表示某一具體單倍型，紅色數(shù)字反應(yīng)兩兩單倍型之間的變異位點(diǎn)Note: Yellow circle represents unique haplotypes, and the red number represents mutation steps

3 討論

FOLMER等[26]認(rèn)為，線粒體基因中A+T含量較高占有優(yōu)勢(shì)。無(wú)論是基于COⅠ基因還是16S rRNA基因，13個(gè)群體的日本花棘石鱉堿基組成顯示了較高的A+T含量，與中國(guó)沿海16種簾蛤目的研究結(jié)果一致[34]。

COⅠ基因是線粒體氧化呼吸鏈重要的組成成分，基因變異較大；16S rRNA基因是非編碼蛋白基因，不受密碼子編碼的選擇壓力，進(jìn)化速度較為適中[35]。日本花棘石鱉COⅠ基因序列變異程度高于16S rRNA，表明16S rRNA基因比COⅠ基因更保守,COⅠ基因更適合用于種群內(nèi)遺傳研究。這一現(xiàn)象與雙殼類的貽貝屬M(fèi)ytilidae[36]、黑龍江河藍(lán)蛤(Potamocorbulaamurensis)[37]，腹足類的的方斑東風(fēng)螺(Babyloniaareolata)和臺(tái)灣東風(fēng)螺(Babyloniaformosae)[38]、頭足類烏賊目(Sepioidea)[39]研究類似。

生物體進(jìn)化的潛力和抵抗惡劣環(huán)境的生存能力，取決于種群內(nèi)遺傳變異的范圍和種群遺傳結(jié)構(gòu)的分化程度[40]。遺傳多樣性常用核苷酸多樣性和單倍型多樣性等參數(shù)來(lái)衡量[41]?；贑OⅠ基因片段分析，日本花棘石鱉整體核苷酸多樣度(Pi)為0.006 01，單倍型多樣度(Hd)為0.847，略高于雙殼類的文蛤(Meretrixmeretrix)(Pi=0.002 39，Hd= 0.763)[42]和頭足類的曼氏無(wú)針烏賊(Sepiellajaponica)(Pi=0.002 72，Hd=0.576)[24]。物種對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)能力與遺傳多樣性呈正相關(guān)關(guān)系，適應(yīng)能力越強(qiáng)，物種分布范圍越廣[43]。日本花棘石鱉屬于廣鹽廣布種[1]，需要有足夠的變異來(lái)適應(yīng)復(fù)雜的環(huán)境。13個(gè)群體的核苷酸多樣度和單倍型多樣度分別在0.003 0 ～ 0.014 8和0.756～1.000之間，其中南麂島群體的核苷酸多樣度和平均核苷酸差異最高，表明南麂島群體的遺傳背景和遺傳多樣性較豐富；基于16S rRNA基因片段分析，日本花棘石鱉整體核苷酸多樣度為0.001 69，單倍型多樣度為0.665，13個(gè)群體的核苷酸多樣度和單倍型多樣度分別在0.001 0～0.002 9和0.536～0.987之間，其中后麂山群體的核苷酸多態(tài)度和平均核苷酸差異高于其它群體，表明南麂島群體較其它群體有豐富的遺傳多樣性。南麂島和后麂山島同屬于南麂列島，地處臺(tái)灣暖流與江浙沿岸流交匯和交替消漲的海區(qū)，屬亞熱帶海洋季風(fēng)氣候，浪擊度大，鹽度高，氣候環(huán)境較其它海島復(fù)雜多變，導(dǎo)致該地區(qū)日本花棘石鱉遺傳多樣性較高。

浙江南部沿海的日本花棘石鱉遺傳特征總體呈現(xiàn)出單倍型多態(tài)度高，核苷酸多態(tài)度低的特點(diǎn)，這與李玉龍等[44]對(duì)遼東灣和韓國(guó)3個(gè)不同海蜇地理群體研究結(jié)果相似，推測(cè)日本花棘石鱉可能經(jīng)歷了種群擴(kuò)張[45-46]。日本花棘石鱉單倍型多樣性可能在短時(shí)間內(nèi)積累變異而快速提高，而核苷酸多態(tài)性在短時(shí)間內(nèi)尚未達(dá)到這種程度，從而出現(xiàn)高單倍型多樣性，低核苷酸多態(tài)度的現(xiàn)象[47]。不同地理群體單倍型散亂分布，沒有出現(xiàn)明顯的地理結(jié)構(gòu)和遺傳譜系結(jié)構(gòu)，表明各島嶼的日本花棘石鱉為近期分化并存在基因交流。大多數(shù)的海洋生物群體在廣泛的空間內(nèi)存在廣泛的基因流。雖然此研究中的13個(gè)島嶼呈現(xiàn)隔離狀態(tài)，但是海洋環(huán)境影響群體基因交流的阻礙較小，而且洋流可以作為日本花棘石鱉卵、浮游期幼體運(yùn)動(dòng)的媒介，從而加強(qiáng)不同地理群體之間的基因交流。多板綱軟體動(dòng)物是軟體動(dòng)物中較為原始的一個(gè)門類，在進(jìn)化上外形和生活習(xí)性上相對(duì)保守[48-49]；另外，采樣的地理尺度跨越較小，這些可能是導(dǎo)致日本花棘石鱉遺傳差異出現(xiàn)較小積累的原因。綜上所述，浙南不同島嶼分布的日本花棘石鱉遺傳變異較小，尚未達(dá)到種間分化。

致謝：感謝浙江師范大學(xué)張加勇博士在數(shù)據(jù)處理過程中的支持和幫助。

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