李昕 夏舒 張海燕 陳鈺 劉仲明 王捷

廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗科，廣州 510010

微流控系統(tǒng)可用于量小、復(fù)雜液體樣品的高效、快速檢測，同時具有體小質(zhì)輕、操作簡便、攜帶方便等優(yōu)良特性。傳統(tǒng)的以硅、玻璃、石英、高聚物等材料作為基底的微流控芯片耗時長，并且對研制設(shè)備和研制環(huán)境的要求較為苛刻，不利于微流控芯片技術(shù)的發(fā)展和廣泛應(yīng)用。紙張作為一種日常生活中常見的材料，它的滲透性、疏水性和反應(yīng)性均能夠通過簡單的化學(xué)修飾進行調(diào)節(jié)，是一種極具潛力的微流控芯片基底材料。

紙質(zhì)微流控芯片是一種新興的微流控分析技術(shù)平臺，它以紙張作為基底材料，通過各種加工修飾，在紙上形成具有一定構(gòu)造的親/疏水微細通道網(wǎng)絡(luò)，并與相關(guān)的分析儀器共同組成“紙上微型實驗室”[1-3]。

紙質(zhì)微流控芯片制作技術(shù)多樣，包括：1)紫外光刻法[4]；2)折紙法[5]；3)蠟印法[6]；4)噴墨打印法；5)等離子體處理法；6)柔印法；7)PDMS；8)AKD打印法；9)絲網(wǎng)印刷法；10)硅烷UV/O3成型法；11)電路印制技術(shù)等[7]。當前應(yīng)用最廣的是紫外光刻法、蠟印法和折紙法。近年來，將紙質(zhì)微流控芯片與各種分析檢測技術(shù)相結(jié)合的檢測平臺層出不窮，已經(jīng)通過比色法/電化學(xué)法/化學(xué)發(fā)光法/熒光/電化學(xué)發(fā)光法實現(xiàn)了多種生物化學(xué)物質(zhì)的快速檢測[8-12]。Zhang課題組[13]將CCD圖像傳感器應(yīng)用于紙質(zhì)微流控芯片化學(xué)發(fā)光/電化學(xué)發(fā)光檢測平臺，CCD圖像傳感器具有廉價、可與智能手機報告系統(tǒng)相兼容的特點，該檢測平臺具有便攜、傳播便利的優(yōu)勢。

紙質(zhì)微流控芯片流體控制是其設(shè)計和應(yīng)用的瓶頸之一。經(jīng)過近十年探索，逐步發(fā)展為流體滲流時間、方向可控，可自動完成樣品加工處理、樣品孵育、實時試劑混合等多步驟實驗的復(fù)合裝置，在復(fù)雜多步驟檢測實驗中具有良好的應(yīng)用前景。本文對紙質(zhì)微流控芯片液體滲流控制方法及

其在連續(xù)多步驟檢測中的應(yīng)用及成果進展進行綜述。

1 紙質(zhì)微流控芯片液體流速控制方法

操縱液體在紙質(zhì)微流控芯片上的流動是設(shè)計、制作紙質(zhì)微流控芯片的中心環(huán)節(jié)。液體流動控制使在同一個紙質(zhì)微流控裝置中完成多步驟反應(yīng)、多重時間分析檢測成為可能。紙質(zhì)微流控芯片液體流動是一個以毛細管滲透作用為基礎(chǔ)的自發(fā)、被動的過程，主要受到紙張的材質(zhì)和均一性、紙通道空間維度、液體黏度和環(huán)境因素的影響[14]。液體在有孔介質(zhì)中的毛細流動過程可用Lucas-Washburn's方程描述：

式中，l(t)：滲透距離，t：時間，r：孔隙半徑，μ：液體黏度，γ：表面張力，θ：接觸角。

液體流動速度控制分為加快液體在紙質(zhì)微流控芯片的流動速度和減緩流動速度兩個方面。

1.1 減慢液體流動速度

減慢液體流動速度，有利于反應(yīng)充分完成，同時可以通過控制各反應(yīng)試劑的流動速度實現(xiàn)多步驟實驗的自動完成。減緩液體在紙質(zhì)微流控芯片流動速度的方法主要可以分為兩類：1）通過改變紙通道的幾何結(jié)構(gòu)以減緩流速；2）通過化學(xué)物質(zhì)在紙通道沉積改變親水通道中多孔介質(zhì)空隙半徑而減緩流速。

1.1.1 通過改變紙通道的幾何結(jié)構(gòu)減緩流速 Apilux等[15]通過在親水通道中設(shè)計縱向擋板間接增加了紙通道的長度，從而改變各種試劑流動到反應(yīng)區(qū)和檢測區(qū)的時間。他們使用硝酸纖維素膜制作已設(shè)計好通道結(jié)構(gòu)的紙質(zhì)微流控芯片，并將各種試劑儲存于通道的特定位置以控制其到達檢測區(qū)的時間，通過簡單的樣品滴加步驟啟動芯片上的多步驟反應(yīng)，自動完成了用于人體絨毛膜促性腺激素水平檢測的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。Bhushan等[16]報道了一種通過在紙通道的特定位置安裝吸收墊以減緩流速的方法。在到達吸收墊前及通過吸收墊后，液體的流動遵循Lucas-Washburn’s方程。吸收墊的設(shè)計可以有效減緩液體的流動速度，改變各種試劑到達檢測區(qū)的時間。受吸收墊厚度的影響，延遲時間可達3～20min。他們利用該方法制作POCT裝置，實現(xiàn)了瘧疾蛋白Pf HRP2的放大檢測。Shin等[17]報道了一種通過增加紙通道特定區(qū)域表面壓力從而控制液體在多孔通道中流速的方法。當向紙通道特定區(qū)域表面施加壓力時，通道的空隙變小、滲透性變小、液體阻力變大，從而在該區(qū)域?qū)崿F(xiàn)液體流動延時。液體流動速度隨著施加壓力的增大而減小，流速最大可減小740%。他們通過該方法在聚丙烯紙上制作了一種可用于多種液體連續(xù)遞送的裝置，并完成了通過比色法進行結(jié)果判讀的免疫檢測。

1.1.2 通過化學(xué)物質(zhì)在紙通道沉積減緩流速 糖類、蠟等化學(xué)物質(zhì)在紙通道的沉積可以延遲液體流動，液體流動速率可由化學(xué)物質(zhì)的量、濃度控制。Lutz等[18]通過將可溶解的糖類沉積于紙通道的方法，在紙質(zhì)微流控芯片上建立了可控的液體流動延遲系統(tǒng)。他們將不同濃度的糖類（10-70%）滴加到紙通道中并晾干，延遲時間隨糖類濃度增高而增長，可達數(shù)分鐘到一小時。利用此技術(shù)制作的紙質(zhì)微流控系統(tǒng)只需要簡單的一步人工操作激活便可以自動完成四步液體流動反應(yīng)，已用于瘧疾檢測的信號放大“三明治”免疫分析。具有操作簡便、反應(yīng)快速、成本低廉等特點。Jang 等[19]報道通過調(diào)整親水通道中蠟點的疏密程度控制流速。通過調(diào)整親水通道的亮度來控制蠟點的疏密，亮度越低，蠟點越密集，通道的滲透性越低。此方法可以在蠟打印疏水隔離帶時同時完成親水通道中蠟點的打印，實現(xiàn)液體流動的精確控制。

1.2 加快液體流動速度

加快液體流動速度有利于節(jié)省實驗時間，提高非特異結(jié)合物的洗滌效率，可以應(yīng)用于快速、即時檢測POCT系統(tǒng)構(gòu)建。

Giokas等[20]報道的方法既可實現(xiàn)液體的加速流動，也可減緩液體流速，而無須提供外在的驅(qū)動力。使用Xerox Phaser 8560N蠟打印機制備紙質(zhì)微流控芯片，然后將其放置在加熱器上138±3℃加熱2min，使蠟融化并滲透入Whatman 1號層析紙形成疏水隔離帶。使用線性1200單通道記錄儀在紙質(zhì)微流控芯片親水通道表面雕刻與液體流動方向平行或垂直的開放通道，與液體流動方向平行的開放通道可加快液體流動速度，與液體流動方向垂直的開放通道可減緩液體流動速度。實驗結(jié)果表明當水平方向開放通道的長度達10mm時，液體在親水通道中的流動速度顯著增快；當開放通道的長度進一步增長時，液體流速趨于穩(wěn)定，流動速度與未經(jīng)處理的親水通道相比提高60%。與液體流動方向垂直的開放通道可以減緩液體流動速度，主要與垂直通道數(shù)目相關(guān)，隨著垂直通道數(shù)目的增加，液體流速逐漸減慢。

Conor K等[21]報道了雙層紙通道堆疊的芯片，根據(jù)Lucas-Washburn方程，多孔介質(zhì)半徑的增大可以加快液體滲流。紙張的空隙半徑是恒定的，兩層紙通道堆疊在一起時，兩層紙張之間形成一個空隙，可以間接增大多孔介質(zhì)半徑，從而加快流速。實現(xiàn)該思路方法為：1）使用Xerox Phaser 8560蠟打印機在兩張Whatman 1號層析紙上打印出疏水隔離帶，在對流恒溫烤箱中195℃加熱5min，使表面的蠟融化滲透入層析紙。2）冷卻5min后，使用CLP-680ND打印機在層析紙表面打印四層調(diào)色劑。3）使用Purple Cows 3015c層壓機將兩張層析紙覆蓋有調(diào)色劑的表面層壓結(jié)合（調(diào)色劑作為粘合劑）。實驗結(jié)果表明液體在雙層紙質(zhì)微流控芯片中的滲流速度與傳統(tǒng)的單層紙質(zhì)微流控芯片相比顯著加快。流經(jīng)長度為4.5cm的紙通道，在雙層紙質(zhì)微流控芯片中只需3.1min即可完成，而在單層紙質(zhì)微流控芯片中需要20min。該制作方法比單層復(fù)雜，制作時間較長，適用于長距離液體流動控制及具有復(fù)雜通道網(wǎng)絡(luò)的紙質(zhì)微流控芯片設(shè)計。

2 紙質(zhì)微流控芯片在多步驟實驗中的應(yīng)用

生物分子檢測，尤其是基于免疫反應(yīng)和核酸分子雜交的檢測通常包含有序的多重步驟。與傳統(tǒng)的基于側(cè)向?qū)游鲈淼臋z測方法相比，紙質(zhì)微流控芯片在有序多步驟檢測中具有良好的應(yīng)用前景，而且無須增加手工操作步驟?？梢酝ㄟ^閥門控制技術(shù)、容積限制控制技術(shù)及3D紙質(zhì)微流控芯片制作技術(shù)，實現(xiàn)液體滲流方向和時間的控制，完成復(fù)雜多步驟實驗。

2.1 閥門控制技術(shù)

當液體流動到自動閥門處時，閥門墊吸收液體膨脹，實現(xiàn)閥門的開啟、關(guān)閉或方向改變，閥門觸發(fā)時間可以通過調(diào)整閥門墊的厚度控制，最終實現(xiàn)液體滲流時間、方向和體積的控制。Bhushana等[22]報道的微流控裝置有一個檢測通道、三個試劑通道、一個液體供給通道和一個時間控制通道組成。在各個通道的連接處設(shè)計了四個閥門裝置，包括三個可開啟閥門和一個可關(guān)閉閥門。關(guān)閉閥門被觸發(fā)后可以阻斷液體供給通道對三個試劑通道的液體供給，三個開啟閥門分別控制三種試劑有序向檢測區(qū)流動，該裝置實現(xiàn)了瘧疾病原體多步驟檢測實驗。

2.2 容積限制控制技術(shù)

容積限制控制技術(shù)通過對各種試劑容積及試劑入口與反應(yīng)、檢測區(qū)的距離進行控制實現(xiàn)。不同尺寸的試劑墊會釋放出不同體積的液體，以此改變各種試劑到達反應(yīng)區(qū)和檢測區(qū)的時間，實現(xiàn)各試劑有序地流經(jīng)反應(yīng)區(qū)和檢測區(qū)，完成有序多步驟實驗。基于這一思路，F(xiàn)u等[23]設(shè)計了一種集信號放大過程于一體的自動免疫檢測微流控芯片，實現(xiàn)了瘧疾蛋白Pf HRP2的快速、自動檢測。該紙質(zhì)微流控芯片有一個檢測區(qū)，三個試劑區(qū)，不同試劑區(qū)試劑墊的尺寸及試劑入口到檢測區(qū)的距離不同，從而控制三種試劑有序流經(jīng)檢測區(qū)，完成復(fù)雜多步驟實驗。設(shè)計者將三種試劑以凍干粉的形式貯存于試劑墊中，使用時只需加入水和樣品即可，操作簡單，易于貯存。

2.3 3D紙質(zhì)微流控芯片

3D紙質(zhì)微流控芯片可以控制復(fù)雜液體在水平和垂直方向的流動（x-y-z方向）[24-26]。Jeong 等[27]報道了一種通過雙面打印和層壓技術(shù)制作3D紙質(zhì)微流控芯片的簡單方法，并使用該方法實現(xiàn)了樣品中白蛋白和葡萄糖的同時檢測。先以蠟打印機在紙的兩面打印蠟圖案，再使用層壓機使蠟融化并滲透入紙張，形成3D紙質(zhì)微流控通道。當紙雙面打印的垂直對稱蠟圖案融化滲透并在紙中相遇時，形成3D垂直通道。當紙雙面打印的垂直非對稱蠟圖案融化滲透入紙張時，形成通道高度比紙張厚度薄的側(cè)向或垂直通道。這兩種類型的3D通道可以同時控制液體在水平和垂直方向的流動。

3 結(jié)論與展望

紙質(zhì)微流控芯片在有序多步驟檢測實驗中具有良好的應(yīng)用前景。流體控制和在有序多步驟實驗中的應(yīng)用一直是紙質(zhì)微流控芯片設(shè)計和應(yīng)用的瓶頸。本文綜述了近年來報道的紙質(zhì)微流控芯片液體滲流控制策略及其在多步驟實驗中的應(yīng)用技術(shù)，同時介紹了三種紙質(zhì)微流控芯片在有序多步驟實驗中的應(yīng)用技術(shù)。

液體滲流控制方法（幾何結(jié)構(gòu)控制法/化學(xué)物質(zhì)沉積法）及紙質(zhì)微流控芯片在多步驟實驗中的應(yīng)用技術(shù)（閥門控制技術(shù)/容積限制控制技術(shù)/3D紙質(zhì)微流控技術(shù)）雖然可以有效控制液體在紙質(zhì)微流控芯片表面的滲流時間和方向，有利于有序多步驟實驗的自動完成，但是制作方法復(fù)雜、制作時間較長，不利于大規(guī)模生產(chǎn)。為滿足商業(yè)生產(chǎn)需要，應(yīng)綜合分析整合各種制作方法的優(yōu)勢，探索更加簡單快捷的方法。

目前紙質(zhì)微流控芯片的應(yīng)用還面臨很多挑戰(zhàn)，其機械韌性較差，需與其他材料相結(jié)合提高機械強度。為避免外界環(huán)境對反應(yīng)的干擾，需要保證一個相對封閉的空間，避免試劑、樣品的滲漏、蒸發(fā)。樣品的殘留問題及如何將紙質(zhì)微流控芯片與檢測儀器集成、整合，進一步拓展其功能，提高檢測的準確性和檢測限，這些問題都值得研究者進行更深入的探索。

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