，，， ，

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南省雙峰縣永豐鎮(zhèn)動(dòng)物防疫站,湖南 婁底 417700；3.湖南省雙峰縣畜牧局,湖南 婁底 410000)

目前,PCR檢測(cè)技術(shù)被廣泛運(yùn)用于豬病檢測(cè)和診斷過(guò)程。病毒核酸的提取效果顯得至關(guān)重要。核酸提取的方法很多，如Trizol法、 RNA提取試劑盒等。Trizol法，既可以用來(lái)分離完整核酸，也可以進(jìn)行大批量的核酸的提取，但是Trizol法操作繁瑣，對(duì)實(shí)驗(yàn)員的要求較高。相比Trizol法，試劑盒提取步驟簡(jiǎn)便。市場(chǎng)上銷售的試劑盒的種類很多，但產(chǎn)品的質(zhì)量參差不齊，這在一定程度上妨礙了實(shí)驗(yàn)員對(duì)特定病原體的檢測(cè)。為了解不同公司核酸提取試劑盒的效果,我們選擇三種國(guó)產(chǎn)試劑盒，以PRRSV活疫苗為樣本，根據(jù)提取的PRRSV核酸濃度和QRT-PCR檢測(cè)結(jié)果，對(duì)這三種核酸試劑盒提取效果進(jìn)行評(píng)估。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)疫苗

豬繁殖與呼吸障礙綜合征活疫苗10頭份(湖南中岸生物藥業(yè)有限公司提供)。

1.2 主要儀器和試劑盒

熒光定量PCR儀(BIO-Rad公司，型號(hào)CFX ConnectTMOptics Module )，超微量核酸分光光度計(jì)(Thermo SCIENTFIC公司提供，型號(hào)Nanodrop2000 ND-2000)，RNA提取試劑盒，三種RNA提取試劑盒共4個(gè)批次，分別編號(hào)為A、B、C1和C2(A試劑盒批次：17052601；B試劑盒批次：20170727204；C1試劑盒批次：012080hgz；C2試劑盒批次：217085hgz)，豬繁殖呼吸綜合癥病毒北美型經(jīng)典株與高致病性變異株實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒(湖南國(guó)測(cè)生物科技有限公司提供)。

1.3 方法

1.3.1 疫苗分組 取2400 μL 稀釋好的豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗，分為12份樣品，200μL/份。將12份樣品分為4組(A、B、C1和C2)，每組3個(gè)。

1.3.2 核酸提取 按照A、B、C三種核酸提取試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行提取。

1.3.3 RNA濃度測(cè)定 按 Nanodrop2000 ND-2000核酸分光光度計(jì)說(shuō)明書進(jìn)行，鑒定步驟如下：先用超純水洗滌點(diǎn)樣口2次，再用無(wú)塵紙擦拭干凈。滴加樣品稀釋溶液1-2μL,蓋上樣品臂，點(diǎn)擊BLANK measure鍵呈綠色，調(diào)零完畢。用無(wú)塵紙擦拭干凈，再滴加樣品檢測(cè)。測(cè)量完成后，清洗儀器，關(guān)閉儀器。

1.3.4 RNA純度測(cè)定 Nanodrop2000 ND-2000核酸分光光度計(jì)檢測(cè)，OD260/OD280顯示結(jié)果表示核酸的純度，純RNA的OD260/OD280值=2.0，純DNA的OD260/OD280值=1.8。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 將每種試劑盒提取的三份PRRSV 核酸樣品合并為一份，12份核酸樣品合并成4份，按照PRRSV QRT-PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行QRT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：反應(yīng)液43μL，酶混合液2 μL，PRRSV內(nèi)置參照0.5μL，充分混勻成PCR-Mix，離心備用。反應(yīng)條件：逆轉(zhuǎn)錄50℃ 30 min，預(yù)變性 95℃ 2min，擴(kuò)增95℃15 s，60℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析 利用SPSS18.0的系統(tǒng)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素均值、標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算分析，兩組樣本間均數(shù)比較，用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α ﹤0.05

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)12份樣品RNA濃度

A、B、C1、C2三種試劑盒，所提取的12份樣品RNA濃度和OD260/OD280值見(jiàn)表1。從表1中可以看出，B試劑盒RNA的濃度最高，為4.4 ng/μL。A、C1、C2試劑盒提取的RNA濃度分別為1.7 ng/μL、3.27 ng/μL、4.13 ng/μL。B試劑盒提取的RNA濃度明顯大于A、C2(P<0.05)。同時(shí)，B試劑盒提取的RNA濃度與D試劑盒提取的RNA濃度相比無(wú)明顯差異(P=0.8)。

表1 三種試劑盒提取RNA的濃度和吸光度比值

2.2 熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果(圖1)顯示：合并后的4份樣品檢測(cè)結(jié)果(Ct值)為： 23.49(A)、21.71(B)、24.97(C1)和25.29(C2)。由于Ct值越小表示作為模板的RNA樣品濃度越高，所以4份合并樣品RNA濃度從高至低的排列順序是：B-A-C1-C2。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，A、B、C1、C2三種試劑盒提取的RNA，理論上RNA 的OD260/OD280比值為2。在純度方面均與理論值一致，但是在濃度方面差異顯著(P<0.05)。

3 討論

用試劑盒提取RNA，影響因素很多。RNA提取原理均是利用酶和裂解液將病毒外膜溶解和RNA釋放，再利用吸附柱將RNA吸附在其表面，最后用洗脫液洗脫收集。在選擇RNA提取試劑盒時(shí)，酶的活性、裂解液的質(zhì)量、吸附柱的吸附效果以及洗脫液的洗脫效率等因素都對(duì)PRRSV的RNA提取效果影響很大。另外，PRRSV是單股正鏈RNA，由于本身化學(xué)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定極易降解，溫度和時(shí)間都會(huì)影響到RNA的提取。在實(shí)驗(yàn)操作中，應(yīng)在低溫環(huán)境下操作，同時(shí)縮短操作時(shí)間。

圖1 四份合并樣品熒光定量RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)三種試劑盒提取PRRSV RNA的效果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)不同試劑盒對(duì)提取RNA有顯著性差異。依據(jù)A、B、C三種試劑盒提取效果比較，優(yōu)先推薦B試劑盒。

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