蘇思尹，郭菊玲

（云南省玉溪市食品藥品檢驗所，云南 玉溪 653100）

葛根為豆科植物野葛或甘葛藤的干燥根，有升陽解肌、透疹止瀉、除煩止渴、清火排毒、調(diào)血脂等功效，故被廣泛應(yīng)用于保健食品中。市售保健食品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中主要以檢測總黃酮為功效指標(biāo)，但由于葛根素有改善外周循環(huán)、抗血小板聚集等臨床藥理作用，長期、大量使用可能存在潛在的出血風(fēng)險，故建議在功效指標(biāo)中增加標(biāo)志性成分葛根素的含量測定，以保證產(chǎn)品的安全性[1－2]。本研究旨在遴選保健食品中葛根素的含量測定方法，以控制功效成分，更合理、安全地開發(fā)和利用葛根資源。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司)，配備 G1322A在線脫氣機，G1311A四元泵，G1329A自動機樣機，G1316A柱溫箱，G1315D二極管陣列紫外檢測器；Sartorius TB－215D型及T－214型電子分析天平（德國賽多利斯公司）；HU10260F型超聲儀（天津市恒奧科技發(fā)展有限公司）。

1.2 試藥

葛根素對照品（批號為 110752－200912，含量為96.0%，購自中國食品藥品檢定研究院）；甲醇為分析純（德國Merck公司）；乙醇為化學(xué)純（天津醫(yī)藥化學(xué)有限公司）；水為超純水（實驗室自制）；18批次不同廠家含有葛根藥材（或葛根素）的保健品(市場抽驗品)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[3]

色譜柱：Agilent Lichrospher C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 － 水（25 ∶75）；流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長：250 nm。

2.2 溶液制備[4]

對照品溶液：稱取葛根素對照品26.06 mg，精密稱定，置25mL容量瓶中，加30%乙醇溶液適量，超聲20 min溶解，冷卻至室溫，用30%乙醇定容至刻度，搖勻，即得。

供試品溶液：取供試品1.0 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加30%乙醇溶液至30 mL，超聲20 min，冷卻至室溫，用 30%乙醇定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密量取 2.2項下對照品溶液0.05，0.10，0.25，0.50，1.00，2.00，5.00 mL，分別置10 mL容量瓶中，加30%乙醇溶液稀釋并定容至刻度，按擬訂色譜條件進樣測定，以峰面積（A）為縱坐標(biāo)（Y）、質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（X）進行線性回歸，得回歸方程 Y＝0.025 4 X＋1.481 4，r＝1.000 0（n＝7）。結(jié)果表明，葛根素質(zhì)量濃度在 4.803 8 ～ 960.768 0 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

檢測限和定量限確定：精密量取質(zhì)量濃度為4.8 μg/mL 的對照品溶液 1 mL，置 100 mL 容量瓶中，用30%乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻。依次改變進樣量，測定出定量限和檢測限。信噪比（S/N）約為1∶3時，進樣量為 5 μL，測定檢測限絕對值為 0.24 ng；S/N 約為1 ∶10 時，進樣量為 35 μL，測定定量限絕對值為 1.68 ng。重復(fù)進樣5次，結(jié)果的 RSD為3.02%（n＝5）。

精密度試驗：精密吸取質(zhì)量濃度為96.076 8 μg/mL的對照品溶液，依法連續(xù)進樣6次，測定峰面積。結(jié)果的RSD為0.08%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一供試品（同仁堂牌同仁益健茶）溶液，分別于 0，1.5，3，6，12，24，48 h 時進樣，測定葛根素峰面積。結(jié)果的 RSD為 0.68%（n＝7），表明常溫下供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗：取供試品（紐斯葆牌葛維片），按2.2項下方法平行配制6份供試品溶液，每份各進樣2次，取平均值，依法測定含量。結(jié)果的 RSD為2.35%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：稱取已知含量的供試品（百邦葛靈膠囊）粉末9份，每份約0.5 g，精密稱定，分為3組，每組分別加入質(zhì)量濃度為 0.576 0 g/L的對照品溶液0.8，1.0，1.2 mL。按 2.2 項下方法制備供試品溶液，依法測定，計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 葛根素加樣回收試驗結(jié)果（n＝9）

2.4 樣品含量測定

取18批次保健品，按2.2項下方法制備供試品溶液，依法測定峰面積，計算樣品含量。結(jié)果見表2。

2.5 樣品處理方法及色譜條件選擇

測定方法選擇：18批保健品中均含有葛根藥材或葛根提取物，但檢測標(biāo)準(zhǔn)中僅有4批測定葛根素功效成分，且有的標(biāo)準(zhǔn)還存在同一指標(biāo)有多種檢驗方法的現(xiàn)象，而不同檢驗方法測定結(jié)果存在較大差異[5－6]。結(jié)果見表3。由于目前國產(chǎn)保健食品多以中草藥為原料，而且組分復(fù)雜，因此，在檢測標(biāo)志性成分葛根素時，采用專屬性較強的高效液相色譜（HPLC）法，以保證檢測結(jié)果的可靠性[7－10]。

提取方法選擇：供試品前處理考慮了超聲、回流、索氏3種提取方法，試驗發(fā)現(xiàn)，超聲提取效率明顯高于其他2種，這與文獻報道的黃酮類提取方法結(jié)果一致，且方便、快捷。

表2 樣品含量測定結(jié)果

表3 不同方法樣品含量測定結(jié)果

流動相選擇：試驗中比較了乙腈－水（11∶89，流動相 A），甲醇 －水（25∶75，流動相 B）對樣品測定的影響，發(fā)現(xiàn)以乙腈－水為流動相時峰形較好，但部分樣品雜質(zhì)峰與主峰不能完全分離，致使樣品含量及加樣回收率均偏大。比較結(jié)果見表4。使用甲醇－水作為流動相時，分離效果明顯（供試品溶液色譜圖理論板數(shù)不低于 5 000，樣品中待測組分與相鄰峰的分離度大于1.5），能保證主峰的分離度，故選用甲醇 － 水（25 ∶75）為流動相。

表4 不同流動相樣品含量測定結(jié)果

提取溶劑選擇：試驗中比較了酸加入水解黃酮苷對提取率的影響，隨著pH的增加含量變化不大，故借鑒了2015年版《中國藥典（一部）》葛根素含量測定方法，直接采用30%乙醇作為提取溶劑。

3 討論

試驗中，有的供試品平行操作的2份樣品含量精密度較差，重新取樣配制后測定，精密度仍不能改善，究其原因可能是：供試品制劑本身均勻度較差，制劑在分裝前未混勻，超聲溶解時難免會出現(xiàn)溶解不充分的現(xiàn)象；個別供試品制劑中的輔料，造成葛根素的峰有一定程度的拖尾，導(dǎo)致積分后的峰面積稍有差異[11]。

本研究中建立的高效液相色譜法操作簡單，檢測快速，分離度好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于檢測保健食品中葛根素的含量，以有效控制保健品中該功效成分。

[1]GB/T22251－2008.中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)[S].

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