劉小強 ，李 丹 ，王 琦 ，任春娥

（1.山東省青島市婦女兒童醫(yī)院，山東 青島 266034； 2.山東省青島市中心醫(yī)院，山東 青島 266031；3.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濰坊 261031）

生殖健康為目前日益凸顯的醫(yī)療難題，環(huán)境污染可引起生殖細胞損傷而導(dǎo)致胎源性疾病發(fā)生，繼而影響胚胎發(fā)育和新生代健康[1－2]。表面活性劑為人工合成的化學(xué)洗滌劑，日常應(yīng)用頻繁，可通過人體直接接觸、餐具、蔬果殘留等多種途徑進入人體。直鏈烷基苯磺酸鈉（linear alkylbenzene sulfonate，LAS）是常見化學(xué)洗滌劑中的表面活性劑成分，在人體內(nèi)含量雖小，但難以消除，長期蓄積會影響動物生殖系統(tǒng)[3－4]。LAS暴露對機體生殖系統(tǒng)的作用受到其暴露的濃度、時間、體內(nèi)代謝方式等多種因素的影響，而在現(xiàn)實生活中受實驗技術(shù)及倫理學(xué)等限制，LAS暴露對宮內(nèi)胚胎及生育功能影響的研究難以展開，主要通過小鼠等動物進行研究[5]。為明確LAS對雌性子代生殖系統(tǒng)的影響，本研究中通過LAS染毒妊娠小鼠，觀察其子代類固醇激素合成情況及可能機制，為預(yù)防和干預(yù)LAS對生殖系統(tǒng)的影響提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物、儀器與試藥

1.1.1 動物

40只妊娠小鼠均來源于南京大學(xué)模式動物研究中心，實驗動物許可證號為scxk（蘇）2010－0001，購買后均單籠飼養(yǎng)，自由攝食和飲水，晝夜節(jié)律正常。本研究符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)我院倫理學(xué)委員會審核批準(zhǔn)。

1.1.2 儀器與試藥

詳見表1。

表1 儀器與試藥名稱及其來源

1.2 方法

1.2.1 分組

將40只小鼠進行編號，并按隨機數(shù)字表法分為研究組和對照組，各20只。分組信息貼于籠子顯眼位置，避免后續(xù)處理錯漏。兩組小鼠的性別、妊娠時間、入組時體質(zhì)量等一般資料比較均無明顯差異（P＞0.05），具有可比性。詳見表2。

表2 兩組小鼠一般資料比較（n＝20）

1.2.2 給藥

研究組于妊娠第5～20天以生理鹽水為溶劑，每天以 150 mg/kg LAS（CAS號為 25155－30－0）灌胃染毒，灌胃溶液體積為每10 g體質(zhì)量 1 mL，期間每5天稱1次體質(zhì)量，并相應(yīng)調(diào)整灌胃溶液體積。對照組小鼠同期每天以等量生理鹽水灌胃。

1.2.3 子代分娩及處理

兩組小鼠均飼養(yǎng)至分娩，期間無死亡，均正常分娩。選出兩組子代雌性小鼠，飼養(yǎng)條件同母代小鼠，飼養(yǎng)、觀察子代雌性小鼠發(fā)育情況至10周齡，子代雌性小鼠發(fā)情間期頸椎脫位處死，取血和卵巢于液氮中速凍冷藏。

1.2.4 血清指標(biāo)檢測

取獲得的血液標(biāo)本以3 500 r/min的轉(zhuǎn)速和3 cm半徑離心處理10 min，分離出上層血清，用于相關(guān)指標(biāo)檢測，采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測并比較兩組子代雌性小鼠血清卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、雌二醇（E2）及睪酮（T）等類固醇激素水平和血清超氧化物歧化酶（SOD）活力、丙二醛（MDA）等氧化應(yīng)激指標(biāo)水平，操作均由同一相關(guān)檢測經(jīng)驗3年以上檢驗科人員進行，具體操作嚴(yán)格儀器及試劑盒說明書進行。

1.2.5 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測和電泳分析

取子代雌性小鼠卵巢，Trizol法常規(guī)提取總RNA后逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，以β－actin作為內(nèi)參照，對卵巢中類固醇激素急性調(diào)節(jié)蛋白（StAR）、細胞色素P450膽固醇側(cè)鏈裂解酶（P450scc）mRNA相對表達量進行檢測，其中StAR上游引物為5′－CTGCTAGACCAGCCCATGGAC －3′，下 游 引 物 為 5′－TGATTTCCTTGACATTTGGGTTCC －3′，片段大小 546 bp；P450scc上游引物為5′－ TCCAGAGGACCCAGGTTCAA －3′，下游引物為 5′－CATCAGGTGTCAAATCTTGGACTT －3′，片段大小 496bp；β－actin 上游引物為 5′－TAAAGACCTCTATGCCAACACAG － 3′，下游引物為 5′－ CACGGATGGAGGGGCCGACTCATC － 3′，片段大小 241 bp。反應(yīng)體系 20 μL，含2 μL 的 10 × Taq Buffer，1.5 μL 的 25 mmol/L MgCl2，1 μL 的 10 mmol/L dNTP，1 μL 的 10 pmol/μL 相應(yīng)上游引物，1 μL 的 10 pmol/μL 相應(yīng)下游引物，1.5 μL 的cDNA 模板，10.5 μL 的 DEPC 水，0.5 μL 的 1 U/μL Taq酶。具體 PCR 反應(yīng)條件：StAR：94℃4 min、94℃0.5 min、50 ℃ 0.5 min、72 ℃0.5 min、72 ℃5 min，共35 個循環(huán)；P450scc，94 ℃4 min、94 ℃0.5 min、50 ℃0.5 min、72 ℃0.5 min、72 ℃5 min，共 30 個循環(huán)；β－actin反應(yīng)條件與目的條件一致。取5 μL PCR產(chǎn)物常規(guī)行凝膠電泳，紫外燈下拍照后采用Image pro Plus圖像分析系統(tǒng)計算光密度值，將目的基因與β－actin基因光密度值比值為目的基因相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析。計量資料均符合正態(tài)分布，組間比較采用獨立樣本 t檢驗，采用Pearson線性相關(guān)分析法分析研究組子代雌性小鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)水平與其血清類固醇激素水平，以及卵巢StAR和P450scc mRNA相對表達量的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組子代性別

兩組小鼠均為單胎妊娠。研究組子代雌性小鼠13只，雄性7只；對照組子代雌性小鼠15只，雄性5只。

2.2 兩組雌性子代血清類固醇激素、氧化應(yīng)激指標(biāo)水平及卵巢不同mRNA相對表達量

與對照組子代雌性小鼠比較，研究組子代雌性小鼠的血清FSH，LH，E2，T等類固醇激素水平，血清SOD活力，以及卵巢StAR和P450scc mRNA相對表達量均降低，血清MDA水平則升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表3、圖1和圖2。

表3 兩組子代雌性小鼠血清類固醇激素、氧化應(yīng)激指標(biāo)水平及卵巢StAR和P450scc mRNA相對表達量比較（n＝20）

圖1 兩組子代雌性小鼠卵巢StAR及mRNA相對表達量

2.3 研究組雌性子代血清氧化應(yīng)激指標(biāo)與類固醇激素及卵巢不同m RNA相對表達量的相關(guān)性

Pearson線性相關(guān)分析結(jié)果顯示，研究組子代雌性小鼠血清 SOD活力與其血清FSH，LH，E2，T等類固醇激素水平及卵巢StAR和P450scc mRNA相對表達量均呈正相關(guān)（r＝0.866，0.805，0.798，0.836，0.818，0.897，P＜0.05），其血清MDA水平與前述類固醇激素水平及卵巢StAR和P450scc mRNA相對表達量則呈負相關(guān)（r＝－0.811， －0.835， －0.872， －0.818， －0.806， －0.857，P ＜ 0.05）。

3 討論

圖2 兩組子代雌性小鼠卵巢P450scc mRNA相對表達量

本研究中采用LAS灌胃妊娠小鼠，并以生理鹽水灌胃為對照，觀察了胚胎期LAS暴露對子代小鼠卵巢類固醇激素合成的影響。結(jié)果顯示，相對于生理鹽水對照組，LAS灌胃妊娠小鼠的子代雌性小鼠的血清FSH，LH，E2，T等類固醇激素水平及卵巢 StAR和 P450scc mRNA相對表達量均降低，其機制可能為LAS導(dǎo)致的生殖細胞結(jié)構(gòu)破壞和凋亡導(dǎo)致類固醇激素合成能力降低，可引發(fā)生殖系統(tǒng)功能紊亂，降低生殖系統(tǒng)功能。LAS為表面活性劑的主要成分，而表面活性劑在日常洗滌中應(yīng)用普遍，因此人體普遍暴露在LAS中，雖量較小，但長期蓄積可能對人體造成一定影響[6－7]。人體中生殖器官極易受到環(huán)境因素的影響，而胚胎期及青春期生殖系統(tǒng)發(fā)育高峰若受到化學(xué)污染物的影響可影響生殖細胞功能，導(dǎo)致體內(nèi)內(nèi)分泌異常，影響生殖系統(tǒng)激素合成分泌，影響生殖功能[8－10]。竇曉衛(wèi)等[11]和韓海艷等[12]的研究均證實了LAS在生殖能力上的負面作用，這與本研究結(jié)果一致。故對LAS相關(guān)生殖系統(tǒng)不良影響進行防治十分重要，明確LAS在生殖系統(tǒng)中的具體影響及其機制可為其相關(guān)不良影響的防治提供依據(jù)。

LAS進入人體后需氧化降解，因此可引發(fā)體內(nèi)自由基水平的明顯升高，從而導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化增強和抗氧化酶活力降低[13]。已有研究證實，LAS可引發(fā)抗氧化能力的降低而導(dǎo)致肝臟功能損傷[14－15]。因此，氧化應(yīng)激的增強亦可能為LAS影響卵巢類固醇激素合成的重要途徑。本研究中亦關(guān)注了LAS對子代雌性小鼠氧化應(yīng)激狀況的影響，結(jié)果顯示，相對于生理鹽水對照組，LAS灌胃妊娠小鼠的子代雌性小鼠的血清SOD活力降低而血清MDA水平則升高，其氧化應(yīng)激反應(yīng)嚴(yán)重，而抗氧化應(yīng)激能力降低，進一步證實了“LAS通過促進氧化應(yīng)激導(dǎo)致妊娠小鼠的子代雌性小鼠卵巢類固醇激素合成功能降低”的假設(shè)，亦與趙文紅等[14－15]的研究中LAS通過氧化應(yīng)激途徑影響細胞功能，造成器官損傷的結(jié)論一致，提示抗氧化可能為減輕LAS對機體造成不良影響的途徑。

本研究結(jié)果顯示，隨著LAS灌胃妊娠小鼠的子代雌性小鼠血清 SOD活力的降低，其血清 FSH，LH，E2，T等類固醇激素水平同步降低，而隨著血清MDA水平的升高，其血清FSH，LH，E2，T等類固醇激素水平規(guī)律下降[16]，提示其氧化應(yīng)激指標(biāo)可能與血清類固醇激素水平及卵巢StAR和P450scc mRNA相對表達量相關(guān)。進一步的Pearson線性相關(guān)分析結(jié)果顯示，研究組子代雌性小鼠血清SOD活力與其血清類固醇激素水平及卵巢StAR和P450scc mRNA相對表達量均呈正相關(guān)，其血清MDA水平與其血清類固醇激素水平及卵巢StAR和P450scc mRNA相對表達量則呈負相關(guān)，受LAS影響妊娠小鼠的子代雌性小鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)異常，且與其類固醇激素水平和卵巢類固醇激素合成能力相關(guān)，進一步證實了胚胎期LAS通過促進氧化應(yīng)激導(dǎo)致妊娠小鼠的子代雌性小鼠卵巢類固醇激素合成功能降低。

綜上所述，LAS可影響雌性小鼠卵巢類固醇激素合成，而氧化應(yīng)激可能為LAS影響卵巢類固醇激素合成的機制和干預(yù)依據(jù)。在LAS暴露廣泛的情況下，適當(dāng)抗氧化干預(yù)可能減少其對子代卵巢類固醇激素合成的影響，改善子代生殖系統(tǒng)功能，尚需進一步研究證實。

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