蔡琳琳 ，姚明江 ，郭 全 ，吳顯文 ，朱堯武 ，許 云 △

（1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院腫瘤科，北京 100091； 2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100091； 3.中藥藥理北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091）

乳腺癌是女性常見(jiàn)惡性腫瘤，發(fā)病率逐年上升[1]。根據(jù)分子分型制訂相應(yīng)臨床決策，可使乳腺癌的治療一直處于精準(zhǔn)醫(yī)療的前列。雌激素受體（estrogen receptor，ER）和（或）孕激素受體（progesterone receptor，PR） 陽(yáng)性的乳腺癌定義為激素依賴型乳腺癌，我國(guó)此類患者占乳腺癌患者總?cè)藬?shù)的50% ～60%[2]，可通過(guò)內(nèi)分泌治療抑制機(jī)體雌激素的分泌，從而降低復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，內(nèi)分泌治療可導(dǎo)致患者下丘腦－垂體－卵巢軸功能紊亂，誘發(fā)月經(jīng)紊亂、面紅潮熱、抑郁、骨質(zhì)疏松等類似圍絕經(jīng)期綜合征的臨床癥狀[3]。隨著內(nèi)分泌治療時(shí)間的延長(zhǎng)，不良反應(yīng)的加重，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量和治療依從性，導(dǎo)致停藥或換藥，影響患者生存期，而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)尚無(wú)有效的治療手段及藥物[4]。近年來(lái)，隨著對(duì)經(jīng)方辨證及用藥研究的不斷深入，其在治療腫瘤方面也起到了重要作用。課題組臨床多年使用自擬柴桂龍牡湯治療乳腺癌，發(fā)現(xiàn)其可緩解乳腺癌內(nèi)分泌的不良反應(yīng)，故本研究中選用ER陽(yáng)性的人乳腺癌細(xì)胞系MCF－7細(xì)胞株進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雌性 SD 大鼠 20只，體質(zhì)量（200±20）g，由軍事科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK－（軍）2012－0004。飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)環(huán)境溫度22～25℃，相對(duì)濕度40% ～70%，照明/黑暗各12 h。

1.1.2 藥物

柴桂龍牡湯顆粒劑，由北京康仁堂藥業(yè)有限公司提供，藥材生產(chǎn)批號(hào)分別為，柴胡15022761，桂枝15019001，芍藥 15015641，半夏 15026182，黃芩 15010742，生龍骨15016901，生牡蠣 15019522，郁金 15020881，伸筋草15013951，生甘草 15013951，川牛膝 15021231，厚樸15019231。

1.1.3 細(xì)胞

MCF－7人乳腺癌細(xì)胞株，購(gòu)于武漢普諾賽生命科技有限公司（產(chǎn)品編號(hào)為CL－0149）。

1.1.4 試劑與儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco公司，批號(hào)為8116362）；胎牛血清（Biowest公司，批號(hào)為S1435S1820）；青 －鏈霉素 PS（Solarbio 公司，批號(hào)為 20150626）；0.25% 胰蛋白酶（Solarbio公司，批號(hào)為 20150605）；MTT 試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，批號(hào)為C1310）；ERα引物、GAPDH引物（廣州易錦生物技術(shù)有限公司）；ERα兔多克隆抗體（ABclonal公司，批號(hào)為 A0296）；β －actin 兔多克隆抗體（沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司，批號(hào)為WL－01845）；辣根過(guò)氧化酶偶聯(lián)的羊抗兔IgG（CST公司，批號(hào)為 7074P2）。凝膠成像儀（Bio－Rad Chemi Doc XRS＋）；SMA－1000型超微量分光光度計(jì)（Meriton公司）；T－GRADIENT型溫度梯度PCR儀（美國(guó)Biometra公司）；Step One Plus型熒光定量 PCR儀（美國(guó) ABI公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠給藥劑量及含藥血清制備

按體表面積折算大鼠給藥劑量，將柴桂龍牡湯（CGLM）分為低（L）、中（M）、高（H）劑量組，劑量分別為1.2，2.4，4.8 g（顆粒）/kg（體質(zhì)量）。蒸餾水配制不同濃度藥物混懸液，相當(dāng)于每 10 mL含藥材顆粒 1.2，2.4，4.8 g。大鼠灌胃體積為每100 g體質(zhì)量 1 mL?？瞻讓?duì)照組給予等量蒸餾水連續(xù)灌胃7 d，末次灌胃后1 h，腹主動(dòng)脈取血，分離血清，56℃，30 min熱滅活處理，0.22 μm 濾膜濾過(guò)、分裝，－20℃冰箱凍存。

1.2.2 人乳腺癌MCF－7細(xì)胞株細(xì)胞培養(yǎng)

人乳腺癌MCF－7細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，恒溫37℃，5%CO2。進(jìn)行細(xì)胞傳代時(shí)，先棄去培養(yǎng)液，隨后用PBS液洗2次，然后加入適量0.25%胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基，制備單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，配制成密度為5×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，傳代培養(yǎng)或鋪板用于試驗(yàn)。

1.2.3 人乳腺癌MCF－7細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)(MTT法)

96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入100 μL細(xì)胞培養(yǎng)懸液（每孔5×103個(gè)細(xì)胞），將細(xì)胞培養(yǎng)板置37℃及5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基，PBS液清洗2次，每孔加入200 μL相應(yīng)含藥培養(yǎng)基，其中空白對(duì)照組含有10%空白大鼠血清，給藥組分別含有柴桂龍牡湯低、中、高劑量10%含藥血清。試驗(yàn)時(shí)用含10%空白大鼠血清DMEM培養(yǎng)基稀釋至所需要的濃度。加藥后再將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置37℃及5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。按說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行MTT染色，λ＝570 nm，測(cè)定光密度(OD)值，計(jì)算各給藥組抑制率。

試驗(yàn)組抑制率（%）＝（空白對(duì)照組 OD值－給藥組OD值）/空白對(duì)照組 OD值×100%

1.2.4 ERα mRNA 表達(dá)檢測(cè)(qPCR 法)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人乳腺癌MCF－7細(xì)胞株細(xì)胞，經(jīng)消化、計(jì)數(shù)，配制成密度為5×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，24 h后更換含藥培養(yǎng)基，將細(xì)胞培養(yǎng)板置37℃及5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)基Trizol裂解細(xì)胞，提取總RNA，采用PCR法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取 cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系總體積 50 μL，ERα及 GAPDH上下游引物各 1 μL、cDNA 模板 2 μL。

ERα 引物：上游引物 5′－GCCCAGCTCCTCCTCATCCTCT－3′；下 游 引 物 5′－GCTCTCAGACTGTGGCAGGGAAAC －3′，擴(kuò)增片段 281 bp。GAPDH 引物：上游引物 5′－AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG －3′，下游引物 5′－ CTGGGCTACACTGAGCACC －3′。

擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性10 min后，9℃ 15 s，60℃1 min，40個(gè)循環(huán)，最后采用熒光定量PCR儀自帶程序進(jìn)行溶解曲線分析，采用2－ΔΔCt法進(jìn)行目的基因的相對(duì)定量。

1.2.5 ERα 蛋白表達(dá)檢測(cè)(Western blot法)

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后接種于10 cm平皿中，細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)/平皿，培養(yǎng)24 h，按對(duì)照組和試驗(yàn)用藥組更換含藥培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育48 h，吸出培養(yǎng)基，冷PBS液洗2次，用冰凍裂解液溶解細(xì)胞，將內(nèi)容物移入離心管，4 ℃，10 000 r/min，離心 15 min，上清液置 －20℃保存?zhèn)溆?。BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

樣品進(jìn)行SDS－PAGE后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用含5% 脫脂奶粉的 PBST（含 0.5%Tween－20的 PBS溶液）室溫封閉1 h，棄溶液，加入含5%脫脂奶粉的PBST稀釋的一抗（一抗 ∶ER ＝1 ∶1 000)，室溫孵育 2 h，PBST洗膜3次，加入含5%脫脂奶粉的PBST稀釋的辣根過(guò)氧化酶偶聯(lián)的二抗，室溫孵育1 h，PBST洗膜3次，加入ECL顯色液，使用Bio－Rad凝膠成像分析系統(tǒng)掃描拍照，并測(cè)定目的條帶的密度值。將上述膜用膜再生液室溫洗脫 20 min，加入 β －actin（作為內(nèi)參）抗體（1 ∶5 000稀釋）反應(yīng)并檢測(cè)。計(jì)算目的蛋白條帶密度/β－actin條帶密度的相對(duì)值，以測(cè)定蛋白表達(dá)水平。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

結(jié)果見(jiàn)圖1至圖3。由圖1可見(jiàn)，對(duì)照組抑制率為（99.99 ± 9.77）%，低劑量組為（93.44 ± 14.14）% ，與對(duì)照組比較，無(wú)顯著性差異（P ＝0.159＞0.05）；中劑量組為（84.87 ±20.30）% ，與對(duì)照組比較，有顯著性差異（P ＝0.004 ＜ 0.01）；高劑量組為（80.00 ±16.93）% ，與對(duì)照組比較，有顯著性差異（P＜0.01）。由圖2可見(jiàn)，對(duì)照組中 ERα mRNA 表達(dá)為 1.00±0.11，低劑量組為1.09±0.71，與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＝0.36 ＞ 0.05）；中劑量組為 1.21 ± 0.11，與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＝0.38＞ 0.05）；高劑量組為1.36±0.19，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＝0.002＜0.01）。由圖 3 可見(jiàn)，對(duì)照組 ERα 蛋白表達(dá)為1.00 ± 0.00，低劑量組為 1.05 ±0.64，與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＝0.60＞ 0.05）；中劑量組為1.39±0.59，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）；高劑量組為 1.44 ± 0.80，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。

圖1 柴桂龍牡湯含藥血清對(duì)MCF－7細(xì)胞的抑制作用

圖2 qPCR法檢測(cè)各組ERα mRNA表達(dá)

圖3 Western blot方法檢測(cè)各組ERα蛋白表達(dá)

3 討論

乳腺癌的內(nèi)分泌治療多從雌激素受體入手，最主要的作用點(diǎn)即是ER拮抗劑，以他莫昔芬為例，其抗腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)作用主要是通過(guò)ERα介導(dǎo)，可穩(wěn)定ERα，使ERα蛋白積聚，上調(diào)其表達(dá)[5－7]。ERα表達(dá)的程度是預(yù)測(cè)三苯氧胺良好應(yīng)答的指標(biāo)，ERα的表達(dá)缺失已被假設(shè)為他莫昔芬耐藥的主要因素。據(jù)報(bào)道，ERα的重新表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)MCF－7細(xì)胞對(duì)他莫昔芬的耐藥[8]。

乳腺癌內(nèi)分泌治療的不良反應(yīng)，中醫(yī)并無(wú)相應(yīng)病名，根據(jù)臨床癥狀，屬“郁證”“汗證”“百合病”“不寐”“臟躁”“絕經(jīng)前后諸證”等范疇。中醫(yī)認(rèn)為，乳腺癌的內(nèi)分泌治療引起腎－天癸－沖任－子宮軸的平衡失調(diào)，導(dǎo)致肝、脾、腎三臟失和，沖任二脈也隨之衰少而引發(fā)諸癥。因本病病因復(fù)雜，癥狀繁多，隸屬中醫(yī)相關(guān)病名較多，臨床多以辨證論治為主，各醫(yī)家臨證各有不同，學(xué)術(shù)理念各有側(cè)重，綜合多篇報(bào)道，多從補(bǔ)益肝腎[9－11]，健脾化濕[12－13]為法立方，均獲得一定臨床療效，但對(duì)其作用機(jī)制研究甚少。

自擬柴桂龍牡湯組方為柴胡、桂枝、芍藥、清半夏、黃芩、生龍骨、生牡蠣等，全方以太陽(yáng)少陽(yáng)同治、調(diào)肝和胃為法，奏燮理陰陽(yáng)、營(yíng)衛(wèi)同調(diào)為主。本中藥復(fù)方主要用藥均有抗腫瘤作用，柴胡[14]1 h和2 h的含藥血清對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF－7生長(zhǎng)均有明顯的抑制作用，尤以1 h的含藥血清抑制最明顯；桂枝[15]比其主要成分肉桂酸抗腫瘤效果更強(qiáng)，其60%乙醇提取物能顯著抑制乳腺癌MCF－7細(xì)胞生長(zhǎng)，表明桂枝有其他成分同時(shí)起抗腫瘤作用。Yang等[16]采用MTT法篩選出郁金有較強(qiáng)的逆轉(zhuǎn)人乳腺癌MCF－7細(xì)胞株的多藥耐藥性的能力。有研究發(fā)現(xiàn)，赤芍總苷可通過(guò)影響細(xì)胞凋亡周期的基因、阻滯細(xì)胞增殖周期等誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而起到抗腫瘤作用[17]。

本研究中最初從本復(fù)方安全性出發(fā)，僅觀察對(duì)乳腺癌生長(zhǎng)密切相關(guān)的ER等指標(biāo)，并未涉及與內(nèi)分泌治療聯(lián)合使用的療效，也未設(shè)計(jì)絕經(jīng)后的大鼠模型，未觀察對(duì)絕經(jīng)后乳腺癌細(xì)胞增殖的影響，以及與芳香化酶抑制劑（AI）的聯(lián)合作用?，F(xiàn)階段發(fā)現(xiàn)，柴桂龍牡湯有與他莫昔芬類似的抗腫瘤機(jī)制，提示其與內(nèi)分泌治療藥物聯(lián)用或能更好地控制腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，尤其能為ER拮抗劑提供作用靶點(diǎn)，延長(zhǎng)其使用時(shí)間，或可能逆轉(zhuǎn)內(nèi)分泌耐藥。另外，本研究中也從體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)層面為臨床使用本方提供了安全性評(píng)價(jià)依據(jù)，其對(duì)ERα的作用也為下階段進(jìn)一步研究本方作用靶點(diǎn)，聯(lián)合內(nèi)分泌用藥的協(xié)同性及進(jìn)一步在臨床擴(kuò)大使用提供了科學(xué)依據(jù)。

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