趙芳 許春偉 魏建國 梁文清 吳芬英 王寧

宮頸癌是全球女性第二種最常見的惡性腫瘤，宮頸癌的浸潤和轉(zhuǎn)移是腫瘤患者死亡的最主要原因之一。目前宮頸癌的綜合治療盡管包括手術(shù)、化療及放療等不同手段，但患者的5年生存率仍然未見明顯提高[1]。近年來，宮頸癌發(fā)病呈年輕化趨勢，并且出現(xiàn)易復(fù)發(fā)及易早期轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，腫瘤一旦發(fā)生復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，綜合治療效果極差。因此，在目前基因研究的基礎(chǔ)上，尋找有效的基因治療靶點(diǎn)，可能是提高患者預(yù)后的關(guān)鍵舉措之一。而Msi1是最近才發(fā)現(xiàn)的一種特殊的RNA結(jié)合蛋白，研究證明Msi1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)展和干細(xì)胞的生長增殖過程中均發(fā)揮著十分重要的作用[2]。近年來多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)Msi1在多種惡性腫瘤中高表達(dá)[3-4]。研究認(rèn)為Msi1基因不僅僅是不同腫瘤的腫瘤干細(xì)胞和（或）祖細(xì)胞的原始標(biāo)志物[5]，而且在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及惡性轉(zhuǎn)歸過程中可能作為一個主控調(diào)節(jié)者，扮演著十分重要的角色[6]。為此，本實(shí)驗(yàn)首先通過RTPCR法檢測Msi1在人宮頸癌Hela細(xì)胞中的表達(dá)情況，然后使用siRNA沉默Msi1的表達(dá)，采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色試驗(yàn)、群體倍增時間分析、平皿克隆實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕及Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)等技術(shù)方法，研究沉默Msi1基因后對人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響情況。

1 材料和方法

1.1 材料 人宮頸癌Hela細(xì)胞由南華大學(xué)腫瘤研究所提供；siRNA片段的設(shè)計(jì)及合成均由上海銳博生物技術(shù)公司完成；轉(zhuǎn)染過程中用到的Lipo2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑和Trizol試劑均來自美國Invitrogen公司；FBS購自杭州四季青生物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（ABScriptⅡ cDNA第一鏈合成試劑盒）購自美國Promega公司；Transwell小室（聚碳酸酯微孔膜孔徑8μm）購自美國Costar公司；MTT購自美國Sigma公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) Hela細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)在含10%FBS的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，放置于37℃、5%CO2、95%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)Hela細(xì)胞在培養(yǎng)瓶底部呈單層片狀彌漫生長時，如果融合貼壁達(dá)到80%時，則進(jìn)行常規(guī)的細(xì)胞傳代；Hela細(xì)胞傳代時常規(guī)吸去培養(yǎng)瓶中的陳舊培養(yǎng)液，用0.25%胰蛋白酶及時消化，同時在倒置顯微鏡下觀察，如果發(fā)現(xiàn)Hela細(xì)胞的胞質(zhì)回縮，Hela細(xì)胞之間的間隙逐漸增大后，立即倒去胰酶，防止細(xì)胞過度消化，立刻加入適量含血清的培養(yǎng)液，吹打Hela細(xì)胞成單細(xì)胞的懸液，然后常規(guī)傳代分裝繼續(xù)培育，準(zhǔn)備足夠量的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 RNA干擾試驗(yàn) 首先配制siRNA-Lipo2000的混合液：（1）輕輕晃蕩搖勻脂質(zhì)體Lipo2000，然后用不含血清的DMEM溶液稀釋適量的Lipo2000，放置于室溫下孵育3min；（2）用不含血清的DMEM稀釋已備好的siRNA片段，最后將稀釋的siRNA片段和稀釋的Lipo2000輕輕混和搖勻，放置于室溫下培養(yǎng)20min，形成siRNA-Lipo2000融合的混和液。siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞：首先取處于對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞按照5×105/孔的原則，接種于6孔板細(xì)胞培養(yǎng)器中，每孔中加入不含抗生素的培養(yǎng)基適量，待Hela細(xì)胞密度達(dá)40%左右時及時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。注意在加入混合液前，應(yīng)該換用1ml無抗生素、無血清的培養(yǎng)基，將已備好的siRNA-Lipo2000混和液加入6孔中，輕輕搖晃孔板使其與細(xì)胞充分混和；最后放置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中孵育5h后，更換含有血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，觀察細(xì)胞鋪滿后備用。

1.4 RT-PCR法檢測宮頸癌Hela細(xì)胞中Msi1 mRNA表達(dá)水平 待6孔板中的Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染Msi1 siRNA 24h后收集細(xì)胞，按Trizol Rengent試劑盒說明，立即提取Hela細(xì)胞的總RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)初步評價RNA的質(zhì)量。按照Promega兩步法試劑盒提供的說明書進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)。Msi1上游引物為5′-AGCATTATCATTACCACGCTCATTT-3′，下游引物為 3′-GATCCTTCAC CGTCTCGACCCTG-5′，擴(kuò)增產(chǎn)物為384bp；β-actin 上游引物為 5′-ATCTGGCACCACACCT-3′，下游引物為 5′-CGTCATACTCCTGCTT-3′，產(chǎn)物大小為838bp。最后對RT-PCR的實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，利用凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.5 MTT比色試驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖速度 將預(yù)備好的Hela細(xì)胞1×105/m接種于96孔板細(xì)胞培養(yǎng)器，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24h后加入siRNA-Lipo2000混合液作為Msi1 siRNA組，同時設(shè)4個平行實(shí)驗(yàn)孔。另設(shè)空白對照組、脂質(zhì)體組及陰性對照組，空白對照組在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)過程中不添加任何試劑，脂質(zhì)體組僅添加脂質(zhì)體試劑，陰性對照組添加FBS作對照實(shí)驗(yàn)；分別放置培養(yǎng)箱中孵育 24、48、72h 后，加 MTT 溶液 20μl/孔（5mg/ml）。繼續(xù)放置于培養(yǎng)箱中孵育3h后終止Hela細(xì)胞的培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)液體，于每孔加入100μl二甲基亞砜，晃蕩振蕩15min，然后置于酶標(biāo)儀上測定各孔波長570時的吸光度（OD）值。

1.6 Hela細(xì)胞群體倍增時間分析 常規(guī)取對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞，按照3×105/孔的原則，將Hela細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)6h，待Hela細(xì)胞貼壁后更換成無抗生素、無血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)分組同前，Msi1 siRNA組加入siRNA-Lipo2000混合液。培養(yǎng)6h后，更換成有血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每24h取4復(fù)孔細(xì)胞計(jì)數(shù)，連續(xù)反復(fù)操作96h，然后求其均值及標(biāo)準(zhǔn)差，最后繪制各組Hela細(xì)胞的生長曲線。腫瘤細(xì)胞群體倍增時間按公式計(jì)算：倍增時間=t×lg2/lg（Nt/N0）（Nt為t時間的細(xì)胞數(shù)，N0為初種細(xì)胞數(shù)）。

1.7 平皿克隆實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆時間分析 常規(guī)取對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞基本完全貼壁后，更換用無血清、無抗生素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)分組同前，Msi1 siRNA組中加入均勻的siRNA-Lipo2000混合液，繼續(xù)培養(yǎng)6h后，更換成含有血清的培養(yǎng)基繼續(xù)孵育，每隔48h重復(fù)以上操作。按照以上培養(yǎng)原則繼續(xù)培養(yǎng)Hela細(xì)胞 14d，最后棄去培養(yǎng)液，用0.01mol/L PBS浸洗3次后放于95%的乙醇溶液中固定8min，最后棄去固定液，然后加入適量甲基紫染色15min，棄去甲基紫染液，放置于空氣中充分干燥。肉眼觀察不同實(shí)驗(yàn)組Hela細(xì)胞的克隆形成情況，并用數(shù)碼相機(jī)拍照。

1.8 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)對細(xì)胞遷移能力分析 將Hela細(xì)胞按照5×105/孔的原則，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，按照以上方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，并進(jìn)行Hela細(xì)胞的培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長至95%左右時，用10μl的Eppendorf Tip頭在單層細(xì)胞上垂直劃過，形成一個均勻的創(chuàng)傷通道。并利用新鮮配置的PBS溶液沖洗細(xì)胞3次后繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。24h后在倒置顯微鏡下觀察傷口通道的愈合情況。用Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算劃痕寬度。計(jì)算公式：遷移距離=初次劃痕創(chuàng)傷通道之間的距離-24h后創(chuàng)傷通道之間的距離，即遷移距離=原劃痕寬度-現(xiàn)劃痕寬度，遷移率=（原劃痕寬度-現(xiàn)劃痕寬度）/原劃痕寬度。

1.9 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)對細(xì)胞侵襲能力分析 首先將無血清的RPMI 1640培養(yǎng)基和10mg/ml的Matrigel以5:1的比例均勻充分混合后，以平均每孔30μl均勻平鋪在Transwell小室的聚碳酸酯微孔膜上制作人工基底膜，然后置于細(xì)胞超凈臺內(nèi)開啟紫外燈照射12h。在Hela細(xì)胞進(jìn)行Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)前30min時，必須重新成膠。將Msi1 siRNA組、空白對照組、脂質(zhì)體組及陰性對照組的Hela細(xì)胞懸液400μl分別接種到成膠的Transwell小室內(nèi)，然后將小室放入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板；在24孔板內(nèi)加入含趨化因子的培養(yǎng)基500μl，然后再放置于37℃，5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；最后將小室中的培養(yǎng)液迅速抽出，用棉簽擦凈上室的細(xì)胞，膜下層的Hela細(xì)胞再用95%乙醇溶液固定30min后進(jìn)行結(jié)晶紫溶液染色，最后在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)下層的Hela細(xì)胞數(shù)。計(jì)算公式為：侵襲抑制率=[（對照組穿膜細(xì)胞數(shù)-處理組穿膜細(xì)胞數(shù)）/對照組穿膜細(xì)數(shù)]×100%。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組宮頸癌Hela細(xì)胞中Msil mRNA表達(dá)水平比較 空白對照組、脂質(zhì)體組和陰性對照組3組之間Msi1 mRNA表達(dá)水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），而Msi1 siRNA組與空白對照組、脂質(zhì)體組和陰性對照組Msi1 mRNA表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。轉(zhuǎn)染24h后空白對照組、脂質(zhì)體組、陰性對照組和Msi1 siRNA組細(xì)胞中Msil mRNA表達(dá)情況見圖1。

圖1 各組宮頸癌Hela細(xì)胞中Msi1 mRNA表達(dá)水平比較（a：電泳圖顯示各組Msi1 mRNA表達(dá)水平；b：柱狀圖顯示Msi1 mRNA表達(dá)水平；與Msi1 siRNA組比較，*P＜0.05）

2.2 Msi1 siRNA對宮頸癌Hela細(xì)胞增殖的抑制作用Msi1 siRNA 轉(zhuǎn)染宮頸癌Hela細(xì)胞24、48、72h后，細(xì)胞的增殖速度顯著降低，Msi1 siRNA組與空白對照組、脂質(zhì)體組和陰性對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），脂質(zhì)體組、空白對照組和陰性對照組3組之間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。

表1 Msi1 siRNA轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后的OD值變化

2.3 Msi1 siRNA對Hela細(xì)胞群體倍增時間的影響Msi1 siRNA組群體倍增時間較空白對照組、脂質(zhì)體組和陰性對照組延長，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表2。

表2 Msi1 siRNA對Hela細(xì)胞群體倍增時間的影響

2.4 平皿克隆實(shí)驗(yàn)分析Msi1 siRNA對宮頸癌Hela細(xì)胞形成克隆能力的影響 與空白對照組、脂質(zhì)體組和陰性對照組比較，Msi1 siRNA組Hela細(xì)胞的生長速度明顯減慢，形成克隆的能力明顯下降，而此結(jié)果與MTT結(jié)果保持一致，表明Msi1 siRNA作用于Hela細(xì)胞后，細(xì)胞生長增殖明顯受到抑制，見圖2（插頁）。

2.5 Msi1 siRNA對宮頸癌Hela細(xì)胞遷移的影響Msi1 siRNA組Hela細(xì)胞遷移率均低于空白對照組、脂質(zhì)體組和陰性對照組（均P＜0.05)，見表3。

表3 Msi1 siRNA對宮頸癌Hela細(xì)胞遷移的影響

2.6 Msi1 siRNA對宮頸癌Hela細(xì)胞侵襲的影響 宮頸癌Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染Msi1 siRNA后，Hela細(xì)胞穿透聚碳酸脂膜的細(xì)胞均數(shù)均明顯低于空白對照組、脂質(zhì)體組和陰性對照組（均P＜0.05），侵襲抑制率均明顯高于空白對照組、脂質(zhì)體組和陰性對照組（均P＜0.05），見表4。

3 討論

全球范圍內(nèi)宮頸癌是女性患者中發(fā)病率僅次于乳腺癌而位居第二位的惡性腫瘤，近年來宮頸癌的發(fā)病年齡一度呈現(xiàn)年輕化趨勢，研究表明宮頸癌的發(fā)生也是一個多步驟、多基因參與的復(fù)雜過程，從不典型增生、原位癌到浸潤性癌，經(jīng)歷了一個漫長的過程。近年來國外研究發(fā)現(xiàn)Msi1基因與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性行為密切相關(guān)[1-4]。

表4 Msi1 siRNA對宮頸癌Hela細(xì)胞侵襲的影響

Msi1是一類在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中特異表達(dá)的RNA結(jié)合蛋白，其在線蟲[7]、果蠅[8-9]的表達(dá)有較高的保守性和特殊性。研究表明哺乳動物中包含Msi1和Msi2兩種結(jié)合蛋白，分別由Msi1和Msi2基因編碼[10-11]。Glazer等[12]研究發(fā)現(xiàn)Msi1基因不僅僅可作為腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物而影響神經(jīng)發(fā)育，它還可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移過程中起十分重要的作用。有研究表明Msi1表達(dá)產(chǎn)物在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、結(jié)腸癌、肝癌、胃癌、食管癌等多種惡性腫瘤中高表達(dá)，其通過促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、抑制惡性腫瘤細(xì)胞的凋亡發(fā)揮作用[13-18]。目前Msi1在各種腫瘤細(xì)胞中的功能尚未被闡述清楚，有研究表明Msi1可以通過增強(qiáng)Notch通路的活性，并維護(hù)周期性依賴性蛋白激酶抑制劑p21CIP1的功能，從而達(dá)到維持腫瘤干細(xì)胞自我更新的能力，進(jìn)一步調(diào)節(jié)其生長發(fā)育[19]。

本實(shí)驗(yàn)將Msi1 siRNA瞬時轉(zhuǎn)染到人宮頸癌Hela細(xì)胞后，通過RT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Msi1基因的表達(dá)水平顯著下降；另外通過MTT實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)分別轉(zhuǎn)染宮頸癌Hela細(xì)胞24、48、72h后，與空白對照組、脂質(zhì)體組和陰性對照組相比，Msi1 siRNA組Hela細(xì)胞的增殖速度明顯降低；同時Hela細(xì)胞的群體倍增時間與其他各組相比明顯延長，表明宮頸癌Hela細(xì)胞經(jīng)Msi1 siRNA作用后，其細(xì)胞增殖周期延長，從而使得Hela細(xì)胞增殖速度明顯減慢。同樣平皿克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明Msi1 siRNA組Hela細(xì)胞的生長明顯減慢，形成克隆的能力顯著下降。同時筆者通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)分別顯示：Msi1 siRNA組Hela細(xì)胞遷移和侵襲能力都明顯下降，以上結(jié)果表明沉默Msi1基因不僅可明顯抑制Hela細(xì)胞的生長和增殖，而且還可以明顯降低Hela細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

綜上所述，Msi1基因的表達(dá)與人宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲有著十分密切的關(guān)系。沉默人宮頸癌Hela細(xì)胞中Msi1基因的表達(dá)，會對Hela細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲有著負(fù)性調(diào)節(jié)的作用，這一發(fā)現(xiàn)可能為治療宮頸癌提供新的分子治療靶點(diǎn)，并進(jìn)一步啟發(fā)抗腫瘤新藥的研制。但是，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展往往是多因素、多步驟共同啟動進(jìn)展的過程，并受到多種因子及涉及不同信號通路途徑的調(diào)節(jié)過程，Msi1基因能否作為一個恰當(dāng)?shù)年P(guān)鍵點(diǎn)從而被用于宮頸癌的分子靶向治療仍然有待于進(jìn)一步研究。

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