周鴻鯤 梅小平 潘杰 褚永權(quán) 姚明 陳亮

胰腺癌發(fā)生是多基因遺傳和表觀遺傳共同作用的結(jié)果，基因異常甲基化是胰腺癌發(fā)病的重要原因之一，抑癌基因的高度甲基化可引起轉(zhuǎn)錄抑制甚至喪失，癌基因低甲基化可使其異?；钴S，表達失控，從而導(dǎo)致細胞異常分化和增殖，發(fā)生癌變[1-2]。DNA甲基化指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)催化下將甲基加到CG二核苷酸的胞嘧啶上,使之變成5甲基胞嘧啶(5-mc)的化學(xué)修飾過程[3]，DNMTs在腫瘤中表達增強，導(dǎo)致抑癌基因(TSG)高甲基化并失活，最終促進腫瘤發(fā)生。目前最常用于去甲基化的藥物有5AzA-cdR和地西他濱兩種核苷類似物，主要通過抑制DNMT的活性而發(fā)揮去甲基化作用[4]。但研究表明這兩種藥物的去甲基化作用特異性低且藥物安全窗小，易導(dǎo)致全部基因組的低甲基化。此外，核苷類似物不良反應(yīng)大，限制了其在臨床上治療腫瘤的應(yīng)用。本課題組前期研究證實大黃素、5AzA-cdR可以通過抑制DNMTs的表達對體外胰腺癌細胞PANC1的抑癌基因p16、RASSF1A、ppENK發(fā)揮一定程度的去甲基化作用[5-7]，當(dāng)兩者聯(lián)合用藥時去甲基化作用更為明顯，故本研究通過建立胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型，在體內(nèi)水平進一步驗證大黃素聯(lián)合5AzA-cdR對p16、RASSF1A、ppENK去甲基化的作用。

材料與方法

一、材料和試劑

大黃素(純度≥98%)、5AzA-cdR購于Sigma公司，分別用DMSO配成10、20 mmol/L溶液儲存于-70℃，實驗前用培養(yǎng)液稀釋成工作濃度。細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心株型)購于上海捷瑞生物工程有限公司，EpiTect?MSP Kit試劑盒購于Qiagen公司。RNA提取試劑盒、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Ferments公司，甲基化引物以及PCR引物由上海捷瑞生物技術(shù)有限公司合成，Anti-RASSF1a抗體、ppENK抗體購于Abcam公司，p16/INK4a抗體購于Epitomics公司。

二、細胞培養(yǎng)和胰腺癌裸鼠移植瘤模型的建立

人胰腺癌細胞株P(guān)ANC1由本研究組引進并保存，常規(guī)培養(yǎng)傳代。4～6周齡的雌性裸鼠BALB/CA-nu(nu/nu)購于上海腫瘤研究所，體重18～20 g，飼養(yǎng)于嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院實驗動物中心無特定病原體(SPF)環(huán)境中，并保持室溫在25℃、相對空氣濕度在40%～60%之間。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，取對數(shù)生長期PANC1細胞，用無血清培養(yǎng)液稀釋，于裸鼠右下腹部皮下注入含5×106個細胞的200 μl細胞懸液，喂養(yǎng)4～5周，待皮下移植瘤體積達到100～150 mm3時隨機分為4組，給予不同治療方案。對照組腹腔注射生理鹽水，大黃素組給予大黃素50 mg/kg灌胃，5AzA-cdR組腹腔注射5AzA-cdR 0.1 mg/kg，聯(lián)合用藥組給予大黃素50 mg/kg灌胃聯(lián)合腹腔注射5AzA-cdR 0.1 mg/kg，每組10只，每3 d治療1次，持續(xù)30 d。用藥期間每6 d用游標卡尺測量腫瘤的長度(L)和寬度(W)，按體積(V)=L×W2/2計算腫瘤體積。最后一次治療后1周處死裸鼠，取移植瘤組織，部分液氮保存，部分用4%甲醛溶液固定。

三、甲基化特異性PCR法(methylmion specific PCR,MSP)檢測抑癌基因甲基化水平

按照細胞/組織基因組DNA提取試劑盒說明書的方法分別提取上述4組移植瘤組織的DNA，分光光度法檢測DNA純度及濃度后，取1 μg DNA按照EpiTect?Bisulfite Kit修飾試劑盒說明書進行亞硫酸鹽修飾。參見本課題組既往發(fā)表的方法[5-7]，修飾后的DNA立即行RASSF1A、p16、ppENK的MSP反應(yīng)，實驗重復(fù)3次。部分修飾后的DNA保存于-20℃冰箱。

四、熒光定量PCR法檢測抑癌基因mRNA表達

應(yīng)用Trizol試劑提取上述4組移植瘤組織的總RNA，按試劑盒說明書先逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA為模板行熒光定量PCR擴增。各個基因引物序列、反應(yīng)體系以及條件參見本課題組既往發(fā)表的文章[5-7]，以GAPDH為內(nèi)參，用p16、RASSF1A、ppENK的灰度值與GAPDH的灰度值比統(tǒng)計分析，實驗重復(fù)3次。

五、蛋白質(zhì)印跡法檢測抑癌基因的蛋白表達

應(yīng)用RIPA裂解液提取上述4組移植瘤組織總蛋白，使用BCA試劑盒定量蛋白后常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測p16、RASSF1A、ppENK蛋白表達，以GAPDH為內(nèi)參?？筽16、RASSF1A抗體工作濃度1∶500稀釋，抗ppENK抗體工作濃度1∶1 000稀釋。最后ECL發(fā)光，X片曝光、顯影、定影。采用Image J軟件進行條帶掃描，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比表示蛋白相對表達量。

六、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、大黃素聯(lián)合5AzA-cdR治療的抑瘤作用

對照組、大黃素組、5AzA-cdR組、聯(lián)合用藥組移植瘤重量分別為(0.28±0.01)、(0.17±0.01)、(0.12±0.02)、(0.08±0.01)g；體積分別為(517±0.02)、(382±0.01)、(232±0.03)、(169±0.01)mm3(圖1)，3個治療組移植瘤的重量及體積均顯著小于對照組，聯(lián)合用藥組又顯著小于2個單獨用藥組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值<0.05或<0.01)。

圖1 聯(lián)合用藥組(1)、5AzA-cdR組(2)、大黃素組(3)、對照組(4)裸鼠移植瘤的的生長狀況

二、大黃素聯(lián)合5AzA-cdR治療對p16、RASSF1A、ppENK甲基化的影響

對照組、大黃素組、5AzA-cdR組、聯(lián)合用藥組移植瘤組織p16、RASSF1A、ppENK甲基化狀態(tài)見表1及圖2。對照組3個基因均呈高甲基化狀態(tài)，大黃素組p16、RASSF1A、ppENK甲基化程度輕微降低， 5AzA-cdR組去甲基化程度顯著強于大黃素組，聯(lián)合用藥組的去甲基化程度又顯著強于單獨用藥組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

注：M：甲基化；U：非甲基化圖2 對照組(1)、大黃素組(2)、5AzA-cdR組(3)、聯(lián)合用藥組(4)大鼠移植瘤p16、RASSF1A、ppENK甲基化狀態(tài)

三、大黃素聯(lián)合5AzA-cdR治療對p16、RASSF1A、ppENK mRNA及蛋白表達的影響

3個治療組裸鼠移植瘤組織p16、RASSF1A、ppENK mRNA及蛋白表達量均顯著高于對照組，聯(lián)合用藥組的表達量又顯著高于單獨用藥組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值<0.05或0.01，表2，圖3)。

圖3 對照組(1)、大黃素組(2)、5AzA-cdR組(3)、聯(lián)合用藥組(4)大鼠移植瘤p16、RASSF1A、ppENK蛋白表達

討 論

大黃素治療胰腺癌的作用包括它可以誘導(dǎo)胰腺癌細胞發(fā)生凋亡，抑制新生血管形成以及聯(lián)合吉西他濱用藥可改善胰腺癌細胞對吉西他濱的耐藥性等方面，但其具體的機制并不是很明確。本課題組既

表1 四組大鼠移植瘤組織p16、RASSF1A、ppENK甲基化狀態(tài)

注：與對照組比較，aP<0.05，bP<0.01

表2 四組大鼠移植瘤組織p16、RASSF1A、ppENK mRNA及蛋白的表達

注：與對照組比較,aP<0.05，bP<0.01

往的研究結(jié)果顯示，大黃素可以通過去甲基化作用使胰腺癌細胞PANC1的抑癌基因p16、RASSF1A、ppENK甲基化水平下降而重新發(fā)揮抗癌活性，尤其當(dāng)大黃素和5AzA-cdR聯(lián)合作用時其作用最強，表明大黃素抗胰腺癌細胞生長不僅可以通過凋亡途徑，亦可以通過對抑癌基因的去甲基化作用途徑。

目前關(guān)于胰腺癌的抑癌基因甲基化研究方興未艾，已報道的關(guān)于胰腺癌抑癌基因有CDKN1C、SPA、RC、TFPI-2、BNIP3、TSLC1、HHIP、MUC2、CXCR4、p16、RASSF1A、ppENK等，它們在胰腺癌組織中都有不同程度的甲基化，與其伴隨的是相應(yīng)的mRNA表達不同程度的缺失，其中研究最多的抑癌基因甲基化主要有p16、RASSF1A、ppENK。Ueki等[8]和Fukushima等[9]報道，超過90%的胰腺癌組織ppENK基因發(fā)生甲基化。Schutte等[10]報道，95%的胰腺癌p16基因失活，其中15%和甲基化有關(guān)。Moore等[11]報道，27%的胰腺癌細胞系p16基因發(fā)生甲基化。Dammann等[12]報道，64%原發(fā)性胰腺導(dǎo)管細胞癌、83%的胰腺內(nèi)分泌腫瘤以及88%的胰腺癌細胞系RASSF1A基因發(fā)生甲基化,應(yīng)用去甲基化藥物5AzA-cdR處理胰腺癌細胞后，因去甲基化作用而失表達的ppENK、p16、RASSF1A得到不同程度的重新表達。

本研究的體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，大黃素、5AzA-cdR以及兩者聯(lián)合用藥可以抑制裸鼠移植瘤的生長，兩者聯(lián)合用藥的抑制作用最強；移植瘤組織p16、RASSF1A、ppENK 3個抑癌基因啟動子區(qū)高度甲基化狀態(tài)得到不同程度的逆轉(zhuǎn)，5AzA-cdR去甲基化作用較大黃素強，聯(lián)合用藥的作用更強，同時p16、RASSF1A、ppENK mRNA和蛋白的表達均增加，5AzA-cdR的作用強于大黃素，聯(lián)合用藥的作用又強于單獨用藥，此發(fā)現(xiàn)為大黃素治療胰腺癌的機制研究提供了一個新的思路。

參 考 文 獻

[1] 李慧超, 王寧, 鄭榮壽,等. 中國2010年胰腺癌發(fā)病和死亡分析[J]. 中國腫瘤, 2015, 24(3):163-169.DOI：10.11735/j.issn.1004-0242.2015.03.A001.

[2] Miranda TB, Jones PA. DNA methylation: the nuts and bolts of repression[J]. J Cell Physiol, 2009, 213(2):384-390.

[3] Cheng X, Blumenthal RM. Mammalian DNA methyltransferases: a structural perspective[J]. Structure, 2008, 16(3):341-350.DOI: 10.1016/j.str.2008.01.004.

[4] Brueckner B, Kuck D, Lyko F. DNA methyltransferase inhibitors for cancer therapy[J]. Cancer Journal, 2007, 13(1):17-22.

[5] Zhang H, Chen L, Bu HQ, et al. Effects of emodin on the demethylation of tumor-suppressor genes in pancreatic cancer PANC-1 cells[J]. Oncol Rep, 2015, 33(6):3015-3023.DOI: 10.3892/or.2015.3914.

[6] 陳亮, 郭敬強, 林勝璋,等. 大黃素對胰腺癌細胞抑癌基因P16、RASSF1A去甲基化作用研究[J]. 肝膽胰外科雜志, 2014, 26(4):312-316.

[7] Pan FP, Zhou HK, Bu HQ, et al. Emodin enhances the demethylation by 5-Aza-CdR of pancreatic cancer cell tumor-suppressor genes P16, RASSF1A and ppENK[J]. Oncology Rep, 2016, 35(4):1941-1949.DOI: 10.3892/or.2016.4554.

[8] Ueki T, Toyota M, Skinner H, et al. Identification and characterization of differentially methylated CpG islands in pancreatic carcinoma[J]. Cancer Res, 2001, 61(23):8540-8546.

[9] Fukushima N, Sato N, Ueki T, et al. Aberrant methylation of preproenkephalin, and p16, genes in pancreatic intraepithelial neoplasia and pancreatic ductal adenocarcinoma[J]. Am J Pathol, 2002, 160(5):1573-1581.

[10] Schutte M, Hruban RH, Geradts J, et al. Abrogation of the Rb/p16 tumor-suppressive pathway in virtually all pancreatic carcinomas[J]. Cancer Res, 1997, 57(15):3126-3130.

[11] Moore PS, Sipos B, Orlandini S, et al. Genetic profile of 22 pancreatic carcinoma cell lines[J]. Virchows Archiv, 2001, 439(6):798-802.

[12] Dammann R, Schagdarsurengin U, Liu L, et al. Frequent RASSF1A promoter hypermethylation and K-ras mutations in pancreatic carcinoma[J]. Oncogene, 2003, 22(24):3806-3812.