王國旗，唐佩福

創(chuàng)面污染能否導(dǎo)致感染形成常取決于致病菌的類型和數(shù)量，一般創(chuàng)面軟組織內(nèi)細(xì)菌數(shù)量達(dá)到105CFU/g (tissue)即可認(rèn)為達(dá)到臨床感染標(biāo)準(zhǔn)[1,2]。因此，減少或殺滅軟組織內(nèi)的細(xì)菌是治療軟組組感染的重要目標(biāo)，也是用來衡量軟組織感染治療狀況的重要指標(biāo)之一。負(fù)壓創(chuàng)面療法 (negative pressure wound therapy, NPWT)在嚴(yán)重開放性骨折創(chuàng)面、糖尿病足潰瘍、下肢靜脈潰瘍等治療方面已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用[3-7]。近年來，眾多研究相繼報道NPWT在感染性創(chuàng)面的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)其可以減輕創(chuàng)面感染程度，加速創(chuàng)面愈合[8-11]。然而，目前報道NPWT治療下銅綠假單胞菌感染創(chuàng)面生物膜變化、生物膜成分改變，以及細(xì)菌在軟組織內(nèi)的侵襲深度的研究較少。

1 材料與方法

1.1 巴馬香豬軟組織感染模型 巴馬香豬24只，術(shù)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。經(jīng)過麻醉、脫毛及消毒，在巴馬香豬背部建立一個直徑5 cm深達(dá)肌肉層的軟組織創(chuàng)面，去除肌肉腱膜，充分止血后接種0.5 ml表達(dá)綠色熒光蛋白的銅綠假單胞菌菌液(總菌量為5×107CFU)，涂抹均勻，半透明膜敷料覆蓋24 h，以確保細(xì)菌的穩(wěn)定黏附和定植。本研究經(jīng)過我院動物倫理委員會審查。

半透明膜敷料覆蓋24 h后(建模成功)將巴馬香豬隨機(jī)分為NPWT組(負(fù)壓組)和無菌紗布治療組(對照組)，每組12只，分別進(jìn)行治療。密切觀察敷料變化情況，每兩天更換敷料1次。分別于治療的第4、8、12、16天取材。

1.2 軟組織內(nèi)細(xì)菌計數(shù) 將標(biāo)本稱重并記錄。首先用無菌組織剪充分剪碎組織標(biāo)本，按照組織標(biāo)本與無菌PBS緩沖液的重量比為1∶99的比例混合，于研磨器中再次充分研磨。依照倍比稀釋法按濃度梯度稀釋，最后分別吸取100 μl稀釋液均勻涂抹于LB固體培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)24 h后計數(shù)。選取LB固體培養(yǎng)液細(xì)菌計數(shù)在30～300個作為統(tǒng)計數(shù)據(jù)，每一個濃度梯度涂抹重復(fù)3次，取平均值，最終軟組織內(nèi)細(xì)菌計數(shù)單位為CFU/g tissue。

1.3 生物膜成分eDNA定量分析 取創(chuàng)面敷料1 g，置于離心管中，加入無菌1 ml PBS緩沖液，渦旋震蕩3 min，充分洗脫敷料上的細(xì)菌及生物膜[12,13]。4 ℃， 13 400 g條件下高速離心，去除不溶性物質(zhì)，取100 μl上清液，用微量樣品DNA提取試劑盒抽提其中的eDNA，具體提取過程依據(jù)試劑說明書。采用Qubit? 2.0核酸蛋白定量儀測定DNA濃度，最終每個創(chuàng)面eDNA濃度單位為μg/ml。

1.4 細(xì)菌侵襲深度檢測 取巴馬香豬肌肉組織標(biāo)本。冷凍切片機(jī)內(nèi)切取標(biāo)本，注意標(biāo)記標(biāo)本的創(chuàng)面一側(cè)。激光共聚焦顯微鏡觀察，使用自帶軟件測量細(xì)菌從表面侵襲至最深處的深度并記錄。每組隨機(jī)選取6張，取每一張切片內(nèi)細(xì)菌侵襲深度最深的值作為統(tǒng)計數(shù)據(jù)。圖形制作軟件采用Graphpad prism 5.0。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌計數(shù) 模型建立成功，負(fù)壓組和對照組細(xì)菌計數(shù)均在107CFU/g tissue左右。在治療后的第8天負(fù)壓組軟組織內(nèi)細(xì)菌計數(shù)明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其中負(fù)壓組細(xì)菌計數(shù)達(dá)臨床感染標(biāo)準(zhǔn)105CFU/g 組織左右，而在治療的第16天兩組細(xì)菌計數(shù)均低于臨床感染標(biāo)準(zhǔn)，分別為10～104CFU/g組織和102～105CFU/g組織(圖1)。

圖1 巴馬香豬銅綠假單胞菌感染不同方法治療后

2.2 eDNA分析 治療后第4天創(chuàng)面生物膜成分eDNA定量檢測顯示負(fù)壓組與對照組含量分別為(1.61±0.20)μg /ml和(1.82±0.28)μg /ml，差異開始有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，在治療的第8、12、16天負(fù)壓組eDNA水平均明顯低于對照組(P<0.01, 圖2)。

圖2 巴馬香豬銅綠假單胞菌感染不同方法治療后軟組織創(chuàng)面eDNA對比

治療的第4，8，12，16天負(fù)壓組eDNA水平明顯低于對照組，①P<0.05；②P<0.01

2.3 細(xì)菌侵襲深度分析 建模成功后(day 0)負(fù)壓組和對照組細(xì)菌平均侵襲深度分別為(221.7±22.4)μm和(218.5±31.0)μm，細(xì)菌侵襲深度示意圖見3。隨著治療時間的延長，兩組創(chuàng)面細(xì)菌平均侵襲深度均逐漸減少。但負(fù)壓組細(xì)菌侵襲深度在治療的第4、8、12、16天明顯低于對照組(P<0.05，圖4)。

圖3 激光共聚焦顯微鏡下銅綠假單胞菌在巴馬香豬軟組織內(nèi)的侵襲深度

圖4 兩組巴馬香豬銅綠假單胞菌在軟組織內(nèi)侵襲深度對比

治療的第4、8、12、16天兩組細(xì)菌侵襲深度差異有統(tǒng)計學(xué)意義，①P<0.05；②P<0.01

3 討 論

創(chuàng)面軟組織內(nèi)細(xì)菌數(shù)量一定程度上決定了感染的程度。早前研究多數(shù)致力于探討NPWT治療下創(chuàng)面細(xì)菌數(shù)量的變化，然而未見研究報道NPWT可以將創(chuàng)面軟組織內(nèi)細(xì)菌降至臨床感染標(biāo)準(zhǔn)以下(105CFU/g)，這可能與觀察時間不夠長有關(guān)，因為早前研究多數(shù)觀察至治療后1周左右[figure_title14,15]。本研究采用巴馬香豬軟組織感染模型對NPWT進(jìn)行探索，并觀察至治療的第16天。在觀察至第12天時實驗組細(xì)菌計數(shù)已低于臨床感染標(biāo)準(zhǔn)，在觀察至第16天時兩組細(xì)菌計數(shù)均低于臨床感染標(biāo)準(zhǔn)，但此時實驗組細(xì)菌計數(shù)已達(dá)103CFU/g tissue以下。而創(chuàng)面細(xì)菌數(shù)量的降低的原因可能是以下兩方面，首先是NPWT的持續(xù)引流作用，其次是創(chuàng)面eDNA的減少致使細(xì)菌失去了一定的保護(hù)作用。早前研究報道eDNA是細(xì)菌生物膜的重要組成部分[16-18]，而eDNA成分也能夠支持銅綠假單胞菌的黏附作用[19,20]。而本研究中生物膜的關(guān)鍵成分eDNA定量檢測顯示實驗組在治療后創(chuàng)面eDNA的濃度明顯低于對照組，這說明NPWT可以在治療早期降低創(chuàng)面銅綠假單胞菌生物膜的關(guān)鍵成分。

細(xì)菌在軟組織內(nèi)侵襲的深度決定了感染的深度，也決定了細(xì)菌在創(chuàng)面的哪一個層面定植、增殖。目前，未見報道負(fù)壓環(huán)境下創(chuàng)面細(xì)菌侵襲深度的相關(guān)研究。本研究采用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)菌侵襲深度，結(jié)果顯示NPWT治療下銅綠假單胞菌軟組織內(nèi)侵襲深度明顯低于對照組，這可能有兩方面原因，第一是得益于NPWT的負(fù)壓作用，在負(fù)壓的作用下海綿與創(chuàng)面軟組織貼附緊密并且不斷吸引，而此時的軟組織如果是在海綿的孔內(nèi)則受到負(fù)壓引流作用，如果是與海綿貼附那么軟組織則受到壓力作用，無論是壓力作用還是引流作用可能都不利于細(xì)菌的進(jìn)一步深度侵襲；第二可能是NPWT可以減少生物膜重要成分eDNA，阻礙細(xì)菌在創(chuàng)面的穩(wěn)定黏附和定植，在這種情況下，同時感染所致的壞死物質(zhì)會被及時引流，創(chuàng)面上缺少了保護(hù)細(xì)菌的污物，此時細(xì)菌可能直接面對創(chuàng)面組織細(xì)胞和免疫細(xì)胞，這可能會加大機(jī)體免疫對細(xì)菌的清除作用，也避免了細(xì)菌對創(chuàng)面的進(jìn)一步深度侵襲。而常規(guī)紗布治療組隨著治療時間的延長細(xì)菌侵襲深度也逐漸減小，但其深度均高于負(fù)壓組，這也與在治療期間發(fā)現(xiàn)對照組創(chuàng)面壞死物質(zhì)較多相一致。

本研究的不足是僅采用單一細(xì)菌做感染模型，而臨床中創(chuàng)面感染多為多重細(xì)菌的混合性感染；本研究采取野生型銅綠假單胞菌細(xì)菌作為感染菌株，對抗生素較為敏感，臨床感染菌株常為耐藥性，而本研究未對耐藥性菌株進(jìn)行探索。

綜上所述，NPWT治療銅綠假單胞菌感染性軟組織創(chuàng)面可以清除創(chuàng)面生物膜的重要成分，減少創(chuàng)面細(xì)菌數(shù)量，尤其是在治療的中后期可以將創(chuàng)面細(xì)菌降至臨床感染標(biāo)準(zhǔn)以下，這一速度明顯比常規(guī)的無菌紗布治療方法快。本研究為NPWT治療感染性軟組織創(chuàng)面提供了理論基礎(chǔ)。

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