劉志超，屈亞威，劉海峰

結(jié)腸癌(colon cancer，CC)是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，近年來結(jié)直腸癌新增和死亡率已躍升至國內(nèi)全部癌癥中的第五位[1]。目前，結(jié)腸癌及癌前病變的臨床早期診斷主要依靠消化道內(nèi)鏡檢查和活檢病理診斷，由于多數(shù)早癌形態(tài)結(jié)構變化不明顯且病變活檢定位隨機性高，因此傳統(tǒng)的早期診斷方法存在準確性低、靈敏度低、漏診率高的不足。隨著熒光分子成像(fluorescence molecular imaging，F(xiàn)LI)技術的快速發(fā)展，使得內(nèi)鏡下分子成像輔助診斷成為消化道腫瘤早期診斷、篩查研究的熱點，此方法不僅漏診率低，還能夠?qū)δ[瘤進行精準的靶向治療[2]，因此有望成為早期結(jié)腸癌診斷的新手段。本研究旨在探討利用組織穿透性較高的近紅外[3]熒光染料吲哚菁綠(indocyanine green，ICG)標記人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)的納米探針HSA-ICG，在結(jié)腸癌分子成像中的靶向性和熒光效應，為研發(fā)應用于實際臨床診斷與治療的結(jié)腸癌熒光分子探針打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 活體熒光成像儀(IVIS，Xenogen公司)；980 nm近紅外激光器，購自長春市海洋光電有限公司；Cell DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶均購自GiBCO公司。結(jié)腸癌細胞HCT116(軍事科學院軍事醫(yī)學研究院)；BALB/C裸鼠，SPF級，雌性，4～6周齡，18～22 g，飼養(yǎng)于無菌獨立通風籠盒中，小鼠飼養(yǎng)房室內(nèi)溫度保持在 25 ℃左右，空氣相對濕度保持在40%～70%，用專門為小鼠配制的消毒飼料、純凈水飼喂。每3天更換墊料、食物和水。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將HCT116結(jié)腸癌細胞接種于提前配置好的細胞培養(yǎng)液中，置于培養(yǎng)箱，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)24～48 h,觀察細胞貼壁情況，貼壁達70%～80%后，倒掉培養(yǎng)液，放入25 ml的培養(yǎng)瓶中，向培養(yǎng)瓶中加入2～3 ml胰蛋白酶，充分混勻，邊消化邊取少量細胞懸液在倒置顯微鏡下觀察，當鏡下細胞收回突起變圓或細胞間隙增大時停止消化。吸出消化液，加入少量細胞培養(yǎng)液，反復吹打使細胞脫壁形成懸液。將懸液倒入離心管，再離心1000 r/min，5 min，離心后，倒掉上清液，加入少量DMEM培養(yǎng)液重懸。根據(jù)細胞數(shù)量進行1∶2-1∶3傳代，將細胞懸液倒入松瓶口置于培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2)。

1.2.2 建立裸鼠結(jié)腸癌皮下移植瘤模型 用2.5 g/L的胰酶消化處于生長期的HCT116細胞，離心(1000 r/min，5 min)，加入PBS緩沖液形成重懸液，通過細胞計數(shù)得到細胞數(shù)為 2×107/ml。使用75%乙醇消毒裸鼠右側(cè)肩部部位，皮下注射0.2 ml細胞懸液，待腫瘤長至0.8～1.0 cm時備用，定期更換小鼠墊料及食物、水。

1.2.3 裸鼠結(jié)腸癌皮下移植瘤活體熒光分子成像

1.2.3.1 FolateRsenseTM680探針的FLI 根據(jù)特異性熒光分子探針及免疫組化的相關文獻報道[4，5]，本實驗選用葉酸受體α[6，7](Folate receptor，F(xiàn)Rα)作為目標靶點，并選擇其相對應的商業(yè)化特異性熒光分子探針FolateRsenseTM680，對裸鼠HCT116皮下移植瘤模型進行熒光分子成像。

在IVC籠盒中隨機選取3只成功構建HCT116結(jié)腸癌皮下腫瘤模型的裸鼠，注射探針前吸入異氟烷麻醉后均經(jīng)尾靜脈注射100 μl的FolateRsenseTM680，并于注射前、注射后1、3、7、24、48 h使用IVIS進行FLI。用IVIS Spectrum系統(tǒng)分析，ROI為以成腫瘤部位為中心，直徑為10 mm的圓形區(qū)域，測量各時間點ROI的平均熒光信號強度。

1.2.3.2 注射HSA-ICG納米探針的裸鼠FLI 隨機選取同一批建模成功的3只裸鼠，尾靜脈注射相應HSA-ICG探針200 μg/200 μl。并于注射前、注射后1、3、7、24、48 h使用IVIS進行FLI。探針注射后同樣進行FLI。用IVIS Spectrum系統(tǒng)分析，ROI為以成腫瘤部位為中心，直徑為10 mm的圓形區(qū)域，測量各時間點的ROI平均熒光信號強度。

1.2.3.3 注射ICG探針的裸鼠FLI 隨機選取同一批建模成功的3只裸鼠，尾靜脈注射相應ICG探針200 μg/200 μl。并于注射前、注射后1、3、7、24、48 h使用IVIS進行FLI。探針注射后同樣進行FLI。用IVIS Spectrum系統(tǒng)分析，ROI為以成腫瘤部位為中心，直徑為10 mm的圓形區(qū)域，測量各時間點ROI的平均熒光信號強度。

2 結(jié) 果

兩種探針注射后分別進行FLI，結(jié)果顯示與對照探針I(yè)CG相比，商用的熒光探針及構建的HSA-ICG納米探針在裸鼠結(jié)腸癌皮下移植瘤模型中均有較強的熒光信號，且信噪比好。FolateRsenseTM680及HSA-ICG在裸鼠肝癌皮下移植瘤模型中濃聚高峰時間分別為1 h及24 h(圖1、2、3)，且平均熒光信號均比ICG強。而作為對照的ICG主要在肝臟部位聚集，故肝臟信號特別強，腫瘤部位無特別明顯的腫瘤聚集(圖4)。ICG主要通過肝臟代謝排出體外，故ICG在肝臟部位聚集最多。說明HSA-ICG能夠達到結(jié)腸癌腫瘤熒光標記診斷作用。

圖1 注射HSA-ICG后結(jié)腸癌裸鼠移植瘤模型活體FLI圖

圖2 注射FolateRsenseTM680后結(jié)腸癌裸鼠移植瘤模型活體FLI圖

圖3 結(jié)腸癌裸鼠兩種特異性熒光探針與ICG對照的平均熒光信號強度隨時間變化圖

圖4 注射ICG后結(jié)腸癌裸鼠移植瘤模型活體FLI圖

3 討 論

早期結(jié)腸癌手術后5年存活率高達90%，而晚期存活率僅為17%[8]，可見，早診斷、早治療可大幅度提高消化道腫瘤患者的生存質(zhì)量和存活率。為實現(xiàn)臨床腫瘤的早期、精準診斷，進一步降低腫瘤患者的病死率，結(jié)合納米醫(yī)學與分子影像技術的早期微創(chuàng)診斷技術已成為臨床研究探索的熱門方向之一。

納米熒光探針主要有無機納米探針和有機納米探針兩類[9]，目前研究較多的無機納米探針材料主要有納米金、熒光納米碳、發(fā)光量子點、磁性納米顆粒及硫化銅等[10-12]，但大多無機材料并不是生物體內(nèi)天然存在的物質(zhì)，降解和代謝相對較難，限制了其在臨床中的應用[13，14]。常見的有機納米探針材料主要是有機近紅外染料[15]、卟啉脂質(zhì)體[16]和高分子聚合物及循環(huán)腫瘤細胞、基質(zhì)金屬酶、單克隆抗體等[17-19]。有機納米材料細胞毒性低、生物安全性好，其中近紅外染料可隨尿液排出體外；聚苯胺、聚吡咯等有機探針雖然不易降解，但也不會溶解并釋放出有毒元素[20]。余祖紅等[21]將腫瘤的標志物基質(zhì)金屬蛋白酶[22](MMPs)與熒光材料偶聯(lián)制備成MMP-2/9探針，該探針對結(jié)腸癌細胞的檢測率高達95%以上，充分證明了聚合物探針具有較強的特異性、靈敏度。有機納米探針具有良好的應用前景，但仍需要解決一些問題如成像深度淺、穩(wěn)定性差、易受自體熒光干擾、潛在毒性研究不透徹等。

目前，既能保證人體安全，又能用于腫瘤的早期診斷、治療而被批準用于臨床的近紅外成像試劑只有吲哚菁綠(ICG)[23，24]。ICG具有兩親性結(jié)構、近紅外吸收特性和發(fā)射熒光特性，既能溶于水又能溶于油脂，可在深層組織中吸收近紅外光，易于標記和跟蹤，但ICG本身具有穩(wěn)定性不高、濃度聚集、體內(nèi)的清除快及靶向性差等缺點。為避免ICG在體內(nèi)的分解和清除，提高探針的穩(wěn)定性和靶向性，利用蛋白質(zhì)的生物相容性強、表面的活性基團便于功能性修飾、可與某些近紅外光譜染料產(chǎn)生共價或非共價相互作用的特性[25]，筆者以蛋白質(zhì)為載體，將ICG制備成聚合物近紅外熒光納米探針，通過分子影像技術靶向標記腫瘤。

HSA是一種生物內(nèi)源性蛋白質(zhì)，無毒、無免疫原性，可與許多外源性物質(zhì)有機結(jié)合，是探針顆粒和靶向藥物的理想載體。本研究對實驗裸鼠結(jié)腸癌皮下移植瘤模型分別尾靜脈注射HSA-ICG、FolateRsenseTM680、ICG，結(jié)果表明，商用的熒光探針及HSA-ICG納米探針在裸鼠結(jié)腸癌皮下移植瘤模型中均有較強的熒光信號，且信噪比好。FolateRsenseTM680及HSA-ICG在裸鼠肝癌皮下移植瘤模型中濃聚高峰時間分別為1 h及24 h。將ICG進行HSA的修飾后并進行納米顆粒化，能將ICG的粒徑變小，使其通過腫瘤時產(chǎn)生EPR效應，從而在腫瘤部位實現(xiàn)特異性聚集，產(chǎn)生腫瘤靶向性。故本實驗證明了HSA-ICG納米探針對結(jié)腸癌的靶向性與商用的FolateRsenseTM680相當，具有很好的光學檢測結(jié)腸癌腫瘤的能力。

HSA-ICG診斷原理簡單成熟、質(zhì)量可控、安全高效，為結(jié)腸癌的早期診斷提供了新的思路，但真正應用于臨床還需進一步分析其在生物組織細胞、臟器層面及整個機體之間的運行機制和潛在毒性。由于臨床對腫瘤診斷與治療的期望值越來越高，納米探針在結(jié)腸癌早期診斷的應用正在不斷走向完善，隨著納米技術的迅猛發(fā)展，將來還會有更多、更加穩(wěn)定、更加安全有效的納米探針應用于腫瘤的臨床診斷，甚至可能研發(fā)出集藥物傳輸、控釋，靶向標記、跟蹤為一體的多功能診療一體化探針。

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