韓輝，林書典，陳道軍，武偉

(海南省人民醫(yī)院腎病風(fēng)濕科，?？?570000)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是2型糖尿病患者的常見并發(fā)癥，早期干預(yù)可逆轉(zhuǎn)微量蛋白尿，如不及時治療可導(dǎo)致慢性腎衰竭甚至死亡[1，2]。隨著我國人口老齡化日趨嚴(yán)重，老年DN的患病率呈逐年上升趨勢，給社會及家庭帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。微小核糖核酸(microribonucleic acid, miRNA)是一類小的非編碼RNA分子，廣泛參與細(xì)胞增殖、凋亡及免疫炎癥反應(yīng)等多種機(jī)體生物學(xué)過程的調(diào)控[3，4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miR-133b可能參與腎間質(zhì)纖維化和腎小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等過程，亦可能參與DN的發(fā)生和發(fā)展[5]。本研究通過檢測老年DN患者血清miR-133b水平，分析miR-133b與老年DN患者腎臟損傷及遠(yuǎn)期預(yù)后的關(guān)系，旨在為老年DN的早期治療提供依據(jù)。

1　對象與方法

1.1　研究對象

選取2016年1月至2017年12月海南省人民醫(yī)院腎病風(fēng)濕科收治的老年2型DN患者182例作為研究對象(DN組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合美國糖尿病協(xié)會2型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；(2)經(jīng)過腎活檢診斷為DN或臨床特點(diǎn)符合DN；(3)年齡≥60歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)急性或慢性腎小球腎炎、尿路感染及其他腎臟疾??；(2)合并酮癥酸中毒、甲狀腺疾病或其他代謝性疾?。?3)近期應(yīng)用免疫抑制劑或服用腎毒性藥物。另選擇同期來我院體檢的健康老年人80名作為對照組，均無心、腦、肝、腎病變，無糖尿病、高血壓及其他代謝性疾病。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)(2016AB08035116)，并獲得患者或家屬簽署的知情同意書。

1.2　研究方法

收集182例患者腎活檢或入院后次日的臨床資料，包括年齡、性別、糖尿病病程、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)、空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin Alc,HbAlc)、血肌酐(serum creatinine,SCr)、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、24 h尿蛋白定量、估算腎小球?yàn)V過率(estimated glomerular filtration rate,eGFR)、血清鈣(calcium,Ca2+)等指標(biāo)。采用腎病分級、間質(zhì)性纖維化和小管萎縮(interstitial fibrosis and tubular atrophy，IFTA)評分及間質(zhì)炎癥來評價腎臟損傷情況，級別或評分越高，說明腎臟病理損傷越重。

再根據(jù)DN組患者miR-133b水平的平均值(5.38±1.28)將182例老年DN患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，分析老年DN患者血清miR-133b水平與患者預(yù)后的關(guān)系。

1.3　實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

抽取所有研究對象的空腹靜脈血3 ml置于未加抗凝劑的離心管中，輕輕顛倒數(shù)次后靜置10 min，于室溫2500轉(zhuǎn)/min離心15 min，分2層，吸取上層血清400 μl轉(zhuǎn)移至EP管中，-70℃保存。嚴(yán)格按照試劑盒說明書提取血清總miRNA，通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總miRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,U6為內(nèi)參照，ABI 7500型實(shí)時熒光定量PCR儀(ABI公司，美國)進(jìn)行擴(kuò)增并對PCR結(jié)果進(jìn)行定量分析。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性10 min、95℃變性15 s、60℃退火60 s進(jìn)行45個循環(huán)，最后38℃延伸5 s。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。每個反應(yīng)體系中熒光信號達(dá)到設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即為Ct值，以U6為內(nèi)參照，采用2-△△Ct法計算miR-133b的相對表達(dá)水平，其中△Ct=Ct目的基因-CtU6，△△Ct=△Ct對照目的基因-△Ct實(shí)驗(yàn)?zāi)康幕颉?/p>

1.4　腎臟結(jié)局

終末期腎病(end-stage renal disease, ESRD)定義為eGFR<15 ml/(min·1.73 m2)或開始接受維持性腎臟替代治療。

1.5　統(tǒng)計學(xué)處理

2　結(jié)　果

2.1　DN組與對照組患者基線資料比較

DN組男性98例，女性84例，年齡60～84(68.2±7.1)歲；對照組男性42例，女性38例，年齡60～78(66.8±7.2)歲。2組年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。DN組血清miR-133b水平(5.38±1.28)明顯高于對照組(1.06±0.25)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.2　影響血清miR-133b水平的單因素分析

不同的糖尿病病程、24 h尿蛋白定量、SCr、BUN及eGFR水平間血清miR-133b比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；老年DN患者不同腎病分級、IFTA評分及間質(zhì)炎癥分級間血清miR-133b水平比較，差異亦均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且隨著腎臟病理損傷程度的增加，血清miR-133b水平顯著升高(P<0.05；表1)。

2.3　血清miR-133b水平與各臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)分析顯示，患者血清miR-133b水平與24 h尿蛋白定量、SCr、BUN、腎病分級、IFTA及間質(zhì)炎癥呈正相關(guān)(r分別為0.492、0.382、0.415、0.463、0.338、0.547，P<0.01)，與eGFR水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.625，P<0.01)。

2.4　老年DN患者血清miR-133b水平與預(yù)后的關(guān)系

取老年DN患者血清miR-133b水平的平均值(5.38±1.28)為界限，將182例DN患者分為低表達(dá)組94例和高表達(dá)組88例。最終有76例進(jìn)入ESRD，其中miR-133b高表達(dá)組(65.9%，58/88)相對于低表達(dá)組(19.1%，18/94)進(jìn)入ESRD的比例顯著增加(χ2=6.175，P=0.006)。

3　討　論

DN是2型糖尿病患者最常見且最嚴(yán)重的慢性合并癥，在老年人中的發(fā)病率明顯升高，已成為危害人類的重大疾病[7]。目前，對DN的早期診斷和預(yù)后評估是腎臟病學(xué)研究的熱點(diǎn)問題。miRNA是一種內(nèi)源性的非編碼微小RNA，其廣泛存在于真核細(xì)胞中，長度約為22個核苷酸，通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因表達(dá)，參與各種重要的生物學(xué)過程，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡、免疫、發(fā)育、代謝、病毒感染及腫瘤發(fā)生等[8，9]。已有研究證實(shí)，一些miRNA參與DN的發(fā)生發(fā)展，影響細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能及微環(huán)境，并形成一個錯綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，有可能成為DN新的治療靶點(diǎn)[10，11]。最近研究表明，檢測miRNA對DN的早期診斷、疾病發(fā)展程度、療效判斷、預(yù)后觀察、特異性藥物設(shè)計等方面都具有重要的意義，未來以miRNA為靶點(diǎn)開發(fā)的藥物將有望應(yīng)用于DN的治療[12]。He等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在DN患者的血清和腎組織以及糖尿病小鼠中miR-135a高表達(dá)，通過抑制瞬時受體電位陽離子通道C1(transient receptor potential canonical channel-1,TRPC1)水平，阻斷Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使纖連蛋白和膠原蛋白沉積，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積，而TRPC1過表達(dá)能扭轉(zhuǎn)miR-135a所致的系膜細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的沉積，進(jìn)而促進(jìn)DN的發(fā)生發(fā)展。Eissa等[14]通過采用qRT-PCR法檢測DN患者和健康對照組尿液miR-133b、miR-342及miR-30a水平，發(fā)現(xiàn)DN患者尿液miR-133b、miR-342及miR-30a水平明顯高于對照組(P<0.01)，提示這3種miRNA可能作為DN患者的尿生物標(biāo)志物。本研究顯示，DN組血清miR-133b水平明顯高于對照組，且影響miR-133b水平的因素有糖尿病病程、24 h尿蛋白定量、SCr、BUN及eGFR水平，其中糖尿病病程≥10年、24 h尿蛋白定量≥3.0 g/24 h、SCr≥150 μmol/L、BUN≥7.5 mmol/L及eGFR<60 ml/(min·1.73 m2)患者的血清miR-133b水平較高，提示血清miR-133b水平與DN患者的病情嚴(yán)重程度相關(guān)，可能參與DN的發(fā)生發(fā)展。DiStefano等[15]研究發(fā)現(xiàn)，血清miRNA水平變化可反映腎功能及腎臟損傷情況，在DN的診斷及預(yù)后預(yù)測上有一定的指導(dǎo)價值。另有研究表明，循環(huán)miRNA可能參與DN的病理機(jī)制，如脂質(zhì)代謝紊亂、氧化應(yīng)激、細(xì)胞外基質(zhì)沉積及腎纖維化，有望作為2型DN早期診斷的新型標(biāo)志物[16]。

表1影響血清miR-133b水平的單因素分析

Item miR-133b levelP valueAge0.262 ≤70 years5.24±1.20 >70 years5.62±1.37Gender0.379 Male5.36±1.25 Female5.52±1.31BMI0.313 <25 kg/m25.28±1.22 ≥25 kg/m25.48±1.26Length of diabetes mellitus0.008 <10 years3.93±0.74 ≥10 years6.52±1.63Proteinuria0.028 <3.0 g/24 h4.50±1.02 ≥3.0 g/24 h6.27±1.56Ca2+0.427 <2.0 mmol/L5.58±1.34 ≥2.0 mmol/L5.25±1.21FBG0.205 <8.0 mmol/L5.13±1.16 ≥8.0 mmol/L5.64±1.35HbA1c0.191 <9.0%5.18±1.20 ≥9.0%5.71±1.39SCr0.005 <150 μmol/L4.42±0.94 ≥150 μmol/L6.53±1.56BUN<0.001 <7.5 mmol/L4.28±0.85 ≥7.5 mmol/L6.64±1.70eGFR<0.001 <60 ml/(min·1.73 m2)7.42±1.93 ≥60 ml/(min·1.73 m2)3.81±0.68Nephrotic grade0.018 Ⅰ4.15±0.83 Ⅱ4.86±1.05 Ⅲ5.52±1.36 Ⅳ7.24±1.80IFTA(score)0.036 04.06±0.78 14.73±1.07 25.64±1.45 36.39±1.61Interstitial inflammation(score)0.025 04.90±1.16 15.87±1.72 26.72±1.81

DN: diabetic nephropathy; BMI: body mass index; FBG: fasting blood glucose; HbA1c: glycosylated hemoglobin A1c; SCr: serum creatinine; BUN: blood urea nitrogen; eGFR: estimated glomerular filtration rate; IFTA: interstitial fibrosis and tubular atrophy

DN的主要病理改變是腎小球硬化，其中腎臟系膜細(xì)胞、足細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞的損傷，均參與腎小球硬化。miRNA參與系膜細(xì)胞肥大、細(xì)胞外基質(zhì)沉積、足細(xì)胞凋亡以及腎小管間質(zhì)纖維化，共同導(dǎo)致腎小球硬化[17]。在DN的發(fā)生和發(fā)展過程中，改善腎臟損傷及早期干預(yù)是DN救治的關(guān)鍵。本研究采用腎病分級、IFTA及間質(zhì)炎癥共3個指標(biāo)來評價腎臟損傷程度，結(jié)果顯示老年DN患者不同腎病分級、IFTA及間質(zhì)炎癥間血清miR-133b水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，且隨著腎臟病理損傷程度的增加，血清miR-133b水平顯著升高，提示血清miR-133b水平與腎功能進(jìn)展及嚴(yán)重程度密切相關(guān)，可作為預(yù)測DN進(jìn)展的重要指標(biāo)。腎小球間質(zhì)性損傷可影響管球反饋平衡，加重腎小球?yàn)V過壓，繼而使腎小球上皮受損，最終導(dǎo)致疾病進(jìn)展及發(fā)生ESRD。本研究中miR-133b高表達(dá)組相對于低表達(dá)組發(fā)展為ESRD的比例增加，推測高水平的miR-133b可產(chǎn)生細(xì)胞毒性，導(dǎo)致間質(zhì)纖維化、小管萎縮和間質(zhì)炎癥。Pearson相關(guān)分析顯示，ESRD患者血清miR-133b水平與24 h尿蛋白定量、SCr、BUN、腎病分級、IFTA及間質(zhì)炎癥呈正相關(guān)，與eGFR水平呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步提示血清miR-133b水平與腎臟病理損傷程度及DN預(yù)后不良有關(guān)。Bhatt等[18]研究亦表明，當(dāng)腎小管間質(zhì)損傷時，血液中miRNA水平顯著升高，而腎小管間質(zhì)損傷與DN患者腎臟預(yù)后不良顯著相關(guān)，這與本研究結(jié)果類似。

綜上所述，老年DN患者血清miR-133b水平明顯升高，且其水平與老年DN患者腎臟損傷及預(yù)后有關(guān)，miR-133b水平較高的患者腎臟損傷程度較嚴(yán)重且預(yù)后較差，因此，檢測miR-133b對老年DN的病情判斷及預(yù)后評估具有一定價值，同時亦為闡明DN發(fā)病的分子機(jī)制提供新的線索。