胡熙耀，萬 超，許明軍，劉敏娟，陳德森

(1. 湖北省十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院)，湖北 十堰 442000；2. 湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 十堰 442000)

骨質(zhì)疏松屬內(nèi)鈣調(diào)節(jié)激素分泌失調(diào)的全身代謝性疾病，尤以50歲以上的絕經(jīng)婦女為嚴(yán)重，患者因鈣、磷、維生素及蛋白質(zhì)等攝入不足，成骨和破骨代謝失衡，骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)改變、骨強(qiáng)度下降且脆性增加，在外力的作用下較易發(fā)生壓縮骨折，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量[1-2]。在骨折愈合過程中，炎性因子白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、IL-17等常影響骨折局部微環(huán)境。IL-1β在誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡的同時，還會誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-17，降解軟骨細(xì)胞基質(zhì)，降低成骨細(xì)胞活性，延緩骨痂形成[3]。而IL-17由活化的T 細(xì)胞產(chǎn)生，可增強(qiáng)破骨細(xì)胞活性并最終導(dǎo)致骨侵蝕[4]。骨生長分化因子2 (GDF2)具有誘導(dǎo)成骨分化和骨形成能力，可促進(jìn)骨痂形成，在骨折愈合過程中扮演重要角色[5]。 中藥治療骨質(zhì)疏松及骨折有獨(dú)特的療效，其中青藤堿是從青風(fēng)藤的干燥根莖中提取的生物堿，具有鎮(zhèn)痛、免疫抑制、抗炎、抗風(fēng)濕及抗腫瘤等作用[6]。其常用制劑有青藤堿緩釋膠囊、鹽酸青藤堿注射液等，臨床常用于治療風(fēng)濕、類風(fēng)濕、骨性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松及骨折等疾病[7]。本研究旨在通過觀察青藤堿對骨質(zhì)疏松性壓縮骨折家兔血清IL-1β、IL-17和骨折處骨痂組織中GDF2的影響，探討其作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供更多理論依據(jù)。

1 實驗資料

1.1實驗動物 SPF級雌性家兔36只，7月齡左右，體質(zhì)量(3.5±0.5)kg，由十堰市太和醫(yī)院實驗動物中心提供，合格證號：4200593344。

1.2試劑及藥品 水合氯醛(揚(yáng)州市奧鑫助劑廠，批號： 015102913)，鹽酸青藤堿腸溶片(煙臺魯銀藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號： 2016122603)；IL-1β、IL-17和GDF2檢測用ELISA試劑盒均由上海信則生物科技有限公司提供。

1.3模型建立方法 家兔適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，用10%水合氯醛(0.2 mL/100 g)腹腔內(nèi)注射麻醉，俯臥位固定，剃毛，于家兔髂嵴頂部上方和腰椎骶棘肌兩側(cè)采用雙切口方法切開家兔背肌，分離出腹腔脂肪團(tuán)中包埋的卵巢和子宮角。先結(jié)扎子宮角上部，然后摘除卵巢，摘除干凈后回納脂肪團(tuán)，分層縫合背肌和皮膚，用雙氧水消毒。術(shù)后肌肉注射地塞米松(1 mg/kg)，2 次/周，共4周[8]。術(shù)后自由攝食、飲水，在20～22 ℃、相對濕度40%～70%的條件下飼養(yǎng)。 4周后再參照張淑嫻等[9]方法建立骨質(zhì)疏松性壓縮骨折模型，即用10%水合氯醛(0.2 mL/100 g)腹腔內(nèi)注射麻醉，雙氧水消毒，切開兔L1-5皮膚，分離背闊肌、棘間肌及韌帶，從椎體側(cè)前方剪斷L1-5椎體前緣，術(shù)后椎體不做內(nèi)固定，2周內(nèi)強(qiáng)迫活動(6 h/d，因家兔的前肢不發(fā)達(dá)，后肢及脊柱背側(cè)肌群、腹側(cè)肌群比較發(fā)達(dá)，且生活體位多以半直立屈曲位為主，負(fù)重集中在后肢，動物清醒后，其覓食活動、強(qiáng)迫運(yùn)動均會使椎體受壓，脊柱在此負(fù)重狀態(tài)下最終會出現(xiàn)壓縮狀態(tài)而形成骨質(zhì)疏松性壓縮骨折[10])。在術(shù)后2周時拍攝骨痂X射線片，發(fā)現(xiàn)椎體有明顯壓縮變短等病理改變?yōu)榻３晒?。將建模成功兔隨機(jī)分為模型組、青藤堿A組、青藤堿B組，每組12只。

1.4干預(yù)方法 在骨質(zhì)疏松性壓縮骨折建模成功后，青藤堿A組和青藤堿B組用事先配制好的10%鹽酸青藤堿腸溶片混懸液分別按每只家兔2 mL/(kg·d)和4 mL/(kg·d)的劑量灌胃，模型組按2 mL/(kg·d)劑量灌胃生理鹽水，3組均1次/d，連續(xù)灌胃1個月。

1.5觀察指標(biāo)

1.5.1骨痂總評分 分別于灌胃10，20，30 d拍攝骨痂 X射線片，對骨痂生長情況進(jìn)行評分。評分標(biāo)準(zhǔn)：斷端邊緣銳利整齊為0分，邊緣模糊為1分，接近消失為2分，全部消失為3分；骨痂密度顯示非常淡為0分，較淡為1分，較深為2分，非常深為3分；骨痂量無為0分，少量骨痂為1分，較多骨痂為2分，填滿為3分。以上3項評分相加為骨痂總評分，分值越高說明愈合越好。

1.5.2血清IL-1β及IL-17水平 分別于灌胃前后取耳緣靜脈血0.1 mL，采用雙抗體夾心法檢測血清IL-1β、IL-17水平。

1.5.3骨痂組織中GDF2表達(dá)情況 取血后處死家兔，剔取骨折處的骨痂組織，每組隨機(jī)取6只兔的骨痂組織研磨后3 000 r/min離心15 min，取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測GDF2表達(dá)水平。

1.5.4骨痂組織中GDF2 mRNA表達(dá)情況 采用半定量RT-PCR 法檢測。取剩余兔的骨痂組織，提取GDF2總RNA，反轉(zhuǎn)錄至cDNA，用GAPDH作為內(nèi)參，PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行半定量分析。GDF2上游引物：5’-ACCGACTAAGCGTACTCTCGC-3’，下游引物：5’-GCAATCACATGCTCACGTCAG-3。 GAPDH上游引物：5’-GCATCCTAAGTACGGATGCCGTAC-3，下游引物：5’-GCACCTACTCCAAGATAGTAC-3。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min 變性， 95 ℃、52 ℃ 30 s，72 ℃30 s，擴(kuò)增40個循環(huán)。檢測時根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出GDF2的分子拷貝數(shù)，用GAPD H的拷貝數(shù)作為基數(shù)進(jìn)行校正，以目的基因拷貝數(shù)/GAPDH拷貝數(shù)之比值表示GDF2 mRNA的相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1各組兔骨痂生長評分比較 灌胃10 d后，X射線片顯示3組均有少量骨痂生長，但3組綜合評分均較低，且3組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。灌胃20 d和30 d后，青藤堿A組和青藤堿B組骨痂生長良好，斷層邊緣逐漸模糊或消失，骨密度大，綜合評分均明顯高于灌胃10 d和模型組(P均<0.05)，但青藤堿A組和青藤堿B組綜合評分比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表 1。

表1 各組兔骨痂生長評分比較分)

注：①灌胃10 d比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

2.2各組兔血清IL-1、IL-17水平比較 灌胃前，3組血清IL-1β、IL-17水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。灌胃結(jié)束后，模型組血清IL-1β、IL-17水平無明顯變化(P均>0.05)；青藤堿A組和青藤堿B組血清IL-1β、IL-17均明顯低于灌胃前及模型組(P均<0.05)，但青藤堿A組和青藤堿B組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 各組兔灌胃前后血清IL-1、IL-17水平比較

注：①與灌胃前比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

2.3各組兔骨痂組織中GDF2和GDF2 mRNA表達(dá)情況 灌胃結(jié)束后，青藤堿A組和青藤堿B組GDF2和GDF2 mRNA表達(dá)水平均明顯高于模型組(P均<0.05)，但青藤堿A組和青藤堿B組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表3。

表3 各組兔骨痂組織中GDF2和GDF2 mRNA表達(dá)情況

注：①與模型組比較，P<0.05。

3 討 論

IL-1β和IL-17作為炎癥因子，參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)。其中IL-1β是一種較強(qiáng)的刺激骨吸收因子，隨著絕經(jīng)后婦女雌激素分泌量降低，機(jī)體對于IL-1β的拮抗作用降低，故骨吸收加速，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的形成[11]。而IL-17可增強(qiáng)破骨細(xì)胞活性，破骨細(xì)胞會通過分泌大量水解酶來溶解骨質(zhì)，使骨小梁變薄、斷裂，最終形成骨質(zhì)疏松[12]。IL-1β與IL-17在炎癥反應(yīng)中有聯(lián)動關(guān)系，IL-1β首先激活一氧化氮合酶而產(chǎn)生一氧化氮，一氧化氮誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡，并能抑制軟骨細(xì)胞增殖和合成蛋白多糖[13-14]；同時IL-1β還會使T 細(xì)胞活化，誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-17而降解軟骨細(xì)胞基質(zhì)，降低成骨細(xì)胞活性而破壞骨微結(jié)構(gòu)[15]。因此，抑制IL-1β與IL-17所造成炎性反應(yīng)成為防治骨質(zhì)疏松時骨質(zhì)破壞及可能發(fā)生椎體壓縮骨折的關(guān)鍵。

本實驗首先用雌性家兔去卵巢建立家兔骨質(zhì)疏松模型，再在此基礎(chǔ)上建立椎體壓縮骨折模型，目的是真實模擬老年女性骨質(zhì)疏松性椎體壓縮骨折病理進(jìn)程。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，灌胃20 d和30 d后，青藤堿A組和青藤堿B組骨痂生長良好，綜合評分均明顯高于灌胃10 d和模型組；青藤堿A組和青藤堿B組血清IL-1β、IL-17均明顯低于灌胃前及模型組。提示青藤堿可抑制IL-1β、IL-17表達(dá)，抑制軟骨細(xì)胞凋亡，促進(jìn)骨折愈合。

目前關(guān)于GDF2與骨質(zhì)疏松的關(guān)系研究較少，GDF2為骨形態(tài)發(fā)生蛋白9，屬于轉(zhuǎn)化生長因子，能夠誘導(dǎo)鈣鹽沉積，并可誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為骨、軟骨[16]。本實驗結(jié)果顯示，青藤堿A組和青藤堿B組GDF2和GDF2 mRNA表達(dá)水平均明顯高于模型組，提示青藤堿可誘導(dǎo)骨鈣沉積，提高成骨細(xì)胞活性，促進(jìn)骨痂形成。

綜上所述，青藤堿可以通過抑制IL-1β、IL-17介導(dǎo)的炎性反應(yīng)，提高GDF2誘導(dǎo)成骨分化和骨形成能力，從而促進(jìn)骨痂生長而加速骨折愈合，為青藤堿用于治療老年女性骨質(zhì)疏松性椎體壓縮骨折提供了一定依據(jù)。但本實驗中不同劑量青藤堿未顯示出作用差異，有待進(jìn)一步研究。

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