劉煥龍 陳雪彥 楊秀嶺 尹憲秋 張志清

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部，河北 石家莊 050000)

肺動脈高壓(PAH)是一種致殘率和病死率均很高的臨床綜合征，呈進行性加重，以肺血管阻力升高為特征，與血管收縮、管壁重塑及原位血栓形成三種因素的綜合作用有關(guān)，但確切發(fā)病機制尚未明確。免疫炎癥因素在多種類型PAH形成及血管重塑過程中起著關(guān)鍵性作用，有學(xué)者提出〔1〕肺部炎癥細胞浸潤及炎癥破壞，是無缺氧時肺血管重建和血流動力學(xué)指標改變的重要因素，另外缺氧時期炎癥因子可進一步介導(dǎo)和調(diào)控肺血管構(gòu)型重建，炎癥治療可能成為未來PAH治療的一個新的方向〔2〕。但免疫炎癥反應(yīng)參與肺動脈重構(gòu)的確切機制仍需進一步闡明。研究發(fā)現(xiàn)Rho/ROCK信號通路可能參與多種原因引起的PAH形成過程〔3〕，此通路的異?；钴S也促進了炎癥反應(yīng)的發(fā)生，誘導(dǎo)炎性細胞骨架蛋白的運動，在炎癥的多個環(huán)節(jié)都發(fā)揮重要作用，包括炎癥細胞的遷移、趨化及浸潤〔4〕。Rho激酶抑制劑法舒地爾通過阻斷肌球蛋白輕鏈(MLC) 磷酸化，抑制血管平滑肌的收縮，舒張血管，降低血管阻力。隨著Rho/ROCK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在PAH機制中的研究深入，該藥可能成為預(yù)防和治療PAH新的選擇藥物之一，但其具體作用機制還有待進一步闡明。本文探討法舒地爾對野百合堿(MCT)誘導(dǎo)的PAH大鼠的炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1動物、藥品與試劑、儀器 清潔級雄性SD大鼠30只，體重180～200 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，合格證編號：1503015。MCT購自美國Sigma公司；鹽酸法舒地爾注射液購自天津紅日藥業(yè)股份有限公司，生產(chǎn)批號：1401101；大鼠白細胞介素(IL)-6、TNF-α和MCP-1酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司。BL-420F生物信號分析系統(tǒng)購自成都泰盟科技有限公司；DM2500病理圖像分析系統(tǒng)購自德國萊卡；Floustar多功能微板分析儀購自德國BMG公司。

1.2方法

1.2.1實驗動物分組及處理 30只大鼠隨機分為對照組，模型組，法舒地爾組，每組10只。模型組和法舒地爾組分別一次性皮下注射MCT 60 mg/kg，4 w可形成PAH。對照組皮下注射等量生理鹽水。法舒地爾組自注射MCT之后1 w起以法舒地爾(15 mg/kg)腹腔注射，每日1次。對照組和模型組給予等量生理鹽水。3 w后達到實驗終點，進行各項指標的測定。

1.2.2血流動力學(xué)指標的測定 參照文獻〔5〕方法測定肺動脈壓(PAP)和體循環(huán)壓(SAP)。右心導(dǎo)管預(yù)充肝素生理鹽水后與三通管相連，再經(jīng)生物換能器與生理記錄儀相連。大鼠稱重，腹腔注射3%的戊巴比妥鈉麻醉，頸部消毒后于正中偏右縱向切開皮膚，分離并暴露出右頸外靜脈，并在其下穿入兩根手術(shù)線備用，其中的一根線結(jié)扎血管遠心端，然后用眼科剪一切口，沿此切口向心臟準確地插入導(dǎo)管，輕輕向前推進導(dǎo)管，參考生理記錄儀上所顯示的壓力波形及壓力值來判斷導(dǎo)管口所到達的位置并做好記錄，當(dāng)出現(xiàn)典型的肺動脈壓力波形時固定導(dǎo)管，記錄PAP。同時，分離左側(cè)頸總動脈，插管并檢測SAP。

1.2.3右心肥厚指數(shù)(RVHI)測定 參考相關(guān)文獻〔6〕，血流動力學(xué)指標測定結(jié)束后，取下大鼠心臟，剪去心房及大血管根部，沿后室壁間溝將心臟分離成右心室(RV)和左心室加室間隔(LV+S)兩部分，吸干心肌表面水份，精確稱量RV和LV+S兩部分的重量。RVHI=〔RV/(LV + S)〕×100%。

1.2.4IL-6、TNF-α和MCP-1含量測定 上述血流動力學(xué)指標測定結(jié)束后，腹主動脈取血，靜置后離心，取上層血清分裝后，-70℃冷凍備用。ELISA試劑盒測定炎性因子IL-6、TNF-α和MCP-1含量，具體參照試劑盒說明書操作。

1.2.5肺組織取材及病理檢查 取出大鼠左側(cè)肺葉，置于10%的甲醛中固定3～5 d，進行石蠟包埋并切片，進行HE 染色。顯微鏡觀察肺組織形態(tài)學(xué)變化，分析炎性細胞的浸潤情況。同時利用圖像分析系統(tǒng)測定直徑小于200 μm的肺小動脈管壁厚度(WT)、肺小動脈外徑(ED)、管腔面積(VA)和血管總面積(TVA)，從每只大鼠中選取一張肺組織切片，每張切片連續(xù)觀察10條直徑<200 μm的肺小動脈，分析并測定上述指標。然后分別計算管壁厚度與血管外徑比值(WT%)、管腔面積與血管總面積比值(VA%)，WT%=WT/ED×100%，VA%=VA/TVA×100%。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用Adobe photoshop CS進行圖像處理，SPSS15.0、Origin7.5軟件進行單因素方差分析，Dunnet-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組一般狀況及死亡情況 對照組大鼠皮毛順滑，動作敏捷，飲食正常。模型組大鼠體力虛弱，反應(yīng)較為遲鈍，大多蜷縮少動，皮毛暗淡無光澤，出現(xiàn)呼吸困難癥狀。法舒地爾組治療1 w后活動量較模型組增加，呼吸困難癥狀緩解。實驗動物死亡情況：本實驗共死亡5只大鼠，模型組3只大鼠分別死于實驗第15，18和24天，治療組2只死亡，分別死于第18和24天，大鼠死亡前均表現(xiàn)為呼吸困難、口鼻發(fā)紺。

2.2各組體重變化 對照組大鼠體重穩(wěn)步增長，與第1天相比，第10～28天體重均明顯增加(P<0.01)，模型組大鼠在注射MCT后體重?zé)o明顯增加，法舒地爾組大鼠體重在第20～28體重明顯增加(P<0.01)。見表1。

2.3各組血流動力學(xué)指標及RVHI變化 與對照組相比，模型組PAP和RVHI均明顯升高(P<0.01)，而法舒地爾組PAP和RVHI均較模型組明顯降低(P<0.05)。各組SAP差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.4各組炎性因子IL-6、TNF-α和MCP-1水平比較 與對照組相比，模型組血清炎性因子IL-6、TNF-α和MCP-1含量均顯著升高(P<0.01)。而法舒地爾治療組不同程度降低了上述炎性因子的表達(P<0.05或P<0.01)。見表3。

表1 各組體重變化

與本組內(nèi)第1天比較：1)P<0.01

表2 各組血流動力學(xué)指標及RVHI變化

與對照組比較：1)P<0.01，與模型組比較：2)P<0.05

表3 各組炎性因子水平比較

與對照組比較：1)P<0.01，與模型組比較：2)P<0.05,3)P<0.01

2.5各組光鏡下肺組織炎性情況觀察 對照組肺組織中炎性細胞數(shù)相對較少；模型組肺組織及肺小血管周圍出現(xiàn)大面積炎性細胞浸潤，有淋巴細胞及少量單核細胞和中性粒細胞聚集；而法舒地爾組肺組織中可見各類炎性細胞浸潤現(xiàn)象明顯減輕。見圖1。

圖1 各組肺組織炎性情況觀察(HE，×100)

2.6各組光鏡下肺小動脈形態(tài)學(xué)觀察和構(gòu)型重建分析 肺組織HE染色結(jié)果顯示：對照組大鼠肺小血管內(nèi)表面光滑，內(nèi)皮細胞連續(xù)排列，細胞均勻分布，肺小動脈管壁較薄，管腔較大；而模型組大鼠肺小動脈內(nèi)皮細胞破壞嚴重，呈現(xiàn)斷續(xù)排列，并呈突向血管腔內(nèi)，管壁厚度顯著增加，管腔面積明顯變小；法舒地爾組大鼠肺小動脈內(nèi)皮細胞連續(xù)性有所好轉(zhuǎn)，管壁厚度較模型組明顯縮小，管腔面積明顯擴大，見圖2。與對照組相比，模型組大鼠肺小動脈WT%明顯增加(P<0.01)，而VA%顯著降低(P<0.01)，說明出現(xiàn)了明顯肺血管構(gòu)型重建；而法舒地爾干預(yù)后肺小動脈WT%明顯下降(P<0.05)，VA%顯著增加(P<0.01)，說明法舒地爾明顯抑制了肺血管構(gòu)型重建。

圖2 各組肺組織病理學(xué)觀察(HE，×100)

3 討 論

本實驗結(jié)果與文獻報道〔7〕的結(jié)果一致，證實MCT能夠作用于肺動脈系統(tǒng)，誘導(dǎo)肺小動脈內(nèi)皮損傷，引起炎性細胞浸潤，平滑肌細胞增殖、肥大等一系列病理改變，形成“炎癥性” PAH。

Rho激酶通過抑制肌球蛋白輕鏈磷酸化導(dǎo)致肺動脈平滑肌收縮，其過度激活可造成肺血管強烈收縮，因此，Rho激酶異?；罨荘AH發(fā)生的重要因素之一〔8〕。新興PAH研究靶點通過抑制Rho激酶途徑發(fā)揮舒張肺血管的作用而有益于PAH的治療，但具體機制可能遠非如此，也就是說，抑制Rho激酶后還可能會通過發(fā)揮其他方面的作用而益于PAH的治療。新型異喹啉磺胺衍生物法舒地爾，通過抑制Rho激酶活性阻斷肌球蛋白輕鏈磷酸化，起到舒張血管，降低血管阻力的作用，目前廣泛用于改善及預(yù)防蛛網(wǎng)膜下腔出血術(shù)后的腦血管痙攣及腦缺血癥狀。隨著Rho/ROCK信號通路在PAH發(fā)生發(fā)展中的研究深入，該藥有望成為預(yù)防和治療PAH的選擇藥物之一。本研究顯示法舒地爾能明顯降低PAH大鼠平均PAP 和RVHI，而SAP無明顯變化，與此相一致，F(xiàn)ujita 等〔9〕進行的小樣本臨床研究還表明法舒地爾能降低平均PAP以及肺血管阻力，說明法舒地爾在降低PAH患者肺血管阻力的同時不明顯影響體循環(huán)狀況，安全性較好，同時也說明其作用可能也不僅限于血管擴張作用。

鑒于炎癥參與肺血管重構(gòu)，在PAH形成中起關(guān)鍵作用，而Rho/ROCK通路的異?；钴S也促進了炎癥反應(yīng)的發(fā)生，在炎癥的多個環(huán)節(jié)都發(fā)揮重要作用〔10〕，故

有理由推測Rho/ROCK通路可能參與了PAH發(fā)生發(fā)展過程中的炎性改變。而作為Rho激酶抑制劑的法舒地爾也可能會發(fā)揮一定的抗炎作用，而這必將有益于PAH的治療，也為該藥的臨床新用途提供基礎(chǔ)試驗資料。本研究顯示，模型組炎性因子含量均明顯增高，而法舒地爾明顯降低上述炎性因子表達，且能明顯抑制PAH大鼠的炎癥反應(yīng)，而這可能與其改善MCT誘導(dǎo)的PAH損傷有關(guān)。

目前認為，PAH形成的關(guān)鍵在于肺血管重構(gòu)，因此如何阻止及逆轉(zhuǎn)肺血管重構(gòu)是治療PAH的關(guān)鍵環(huán)節(jié)〔11〕。本研究顯示，法舒地爾能明顯抑制MCT誘導(dǎo)PAH大鼠炎癥反應(yīng)的發(fā)生，這可能是其改善PAH大鼠肺血管重建的重要機制。

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