羅本華 郭雅雯 彭敏家 張亞飛 王 燕 覃斌寧

(廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530001)

記憶減退、認知障礙等為血管性癡呆(VD)核心癥狀。神經(jīng)行為學實驗常用于評估這種認知功能的情況，“益氣調(diào)血、扶本培元”藥線灸法是基于“三焦氣化失司理論”闡釋老年期癡呆的發(fā)病觀〔1〕、病機觀〔2〕及治療觀〔3〕，“益氣調(diào)血、扶本培元”針法多年臨床與實驗研究〔4〕、取穴優(yōu)選組方〔5〕，結(jié)合特色的壯醫(yī)藥線灸刺激新創(chuàng)的一種老年期癡呆灸療新法；已取得其改善VD患者癥狀和認知功能〔6，7〕的證據(jù)，動物實驗證實其改善多發(fā)梗死性癡呆(MID)模型大鼠中樞海馬乙酰膽堿(ACh)、Ach酯酶(AChE)與膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)含量〔8〕的作用，提出其可能通過中樞ACh信息傳遞和信號轉(zhuǎn)導起作用的假設機制。本實驗觀察“益氣調(diào)血、扶本培元”藥線灸法對MID大鼠神經(jīng)行為學的影響。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 健康SPF級Wistar雄性大鼠100只，體重(280±20)g，由廣西醫(yī)科大學動物實驗中心提供；室內(nèi)溫度18℃～22℃，相對濕度45%，室內(nèi)采光按照白晝循環(huán)模式，標準粒飼料定時喂養(yǎng)，自由飲水，適應性喂養(yǎng)15 d。儀器為Eppendorf research plus單道可調(diào)整支消毒移液器(10 μl、200 μl及1 000 μl，編號：3120000)，12號彎錫灌胃針(GWL-12W)，TM-vision行為學實驗系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司)。

1.2動物分組 采用隨機數(shù)字表法將大鼠隨機分為正常組10只、假手術組10只和預用栓子造模組80只；栓子造模組在經(jīng)過MID造模成功53只入選，Morris水迷宮篩選，剔除不符合癡呆標準(8只)及死亡(5只)，最后入選40只，隨機分為模型組、藥線灸組、藥物組和藥線非穴組各10只。

1.3MID造模方法〔9〕取同種大鼠股動脈采血，無菌條件下于37℃溫箱內(nèi)自然干燥24 h，用100目篩子過篩，制備200 μm以下的血凝塊備用。應用時每10 mg血栓加0.3 ml生理鹽水制成混懸液。3.5%水合氯醛按35 mg/100 g體重腹腔麻醉。頸正中切開皮膚(約1 cm)，剝離胸骨舌骨肌、肩胛舌骨肌與胸骨乳突肌，暴露頸外動脈，分離頸外動脈上兩分支，避開兩分支，分別在頸外動脈上備2根手術縫合線，結(jié)扎遠心端，近心端先套一活結(jié)。用兒科4號頭皮針針頭逆行穿刺右頸外動脈至右頸內(nèi)動脈起始處，隨即用1 ml注射器緩慢(60～90 s)注入栓子鹽水懸液0.3 ml，使栓子通過頸內(nèi)動脈進入顱內(nèi)至大腦各動脈，造成多灶性腦梗死，然后結(jié)扎頸外動脈，縫合皮膚。切口處滴注慶大霉素抗感染。假手術組手術方法同模型制作，只是注射時以生理鹽水0.3 ml代替栓子溶液。

1.4模型篩選 栓子造模組于造模后7 d進行Morris水迷宮隱蔽平臺試驗，連續(xù)訓練5 d，2次/d。取第5天正常組逃避潛伏期均值為參考值，同時計算栓子造模組第5天平均逃避潛伏期與參考值之差占該鼠的平均逃避潛伏期時間的比值，該值>20%定為癡呆鼠。符合癡呆條件的動物待用。

1.5干預方法及療程 干預方法：模型組給予藥線灸組相同時間、相同程度的捉抓刺激。藥物組于造模并癡呆篩選后將1 mg·kg-1·d-1鹽酸多奈哌齊溶于2 ml生理鹽水中灌胃，于每日早晨8：00灌胃。藥線灸組治則與取穴，與“益氣調(diào)血、扶本培元”針法相同。藥線灸操作方法：按《壯醫(yī)藥線灸療法》采用2號藥線(直徑0.5 mm)，輕刺激手法點灸，按“先上后下、先軀干再四肢、先陽后陰：次序點灸以上相應腧穴各1壯。藥線非穴組選取雙側(cè)肋下2個固定非穴點，針刺雙側(cè)肋下各兩個固定非穴點〔9〕，約相當于乳正中線外開2.5 mm肋弓下1 mm平行肋弓方向向外下斜刺3 mm；作為對照刺激點，輕刺激手法藥線灸左3右4壯，或左4右3壯，交替。假手術組給予藥線灸組相同時間、相同程度的捉抓刺激。正常組給予藥線灸組相同時間、相同程度的捉抓刺激。療程：各組每天做相應處理1次，第8、16天各停1次，連續(xù)21次治療。

1.6行為學實驗方案測試 Morris水迷宮參照文獻制作〔10，11〕由圖像自動采集和分析系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司，TM-vision行為學實驗系統(tǒng))自動分析和處理，包括動物的逃避潛伏期、游泳路徑、穿越原平臺的次數(shù)、游泳路線的長度等參數(shù)。水迷宮實驗方法與操作參考文獻〔11〕。除探索試驗記錄大鼠在60 s內(nèi)外，其余每次水迷宮時間均設90 s。水迷宮實驗在針刺等干預后次日進行；實驗程序包括第1～2天共2 d的隱蔽平臺試驗，第3天為探索試驗，第4～6天共3 d反向試驗及第7天的可視平臺試驗。取每天兩次檢測的平均潛伏期時間均值為學習成績；以評價各組學習記憶能力變化。

1.7統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0軟件進行方差分析及組間兩兩比較，方差齊時選用LSD法檢驗，方差不齊時選用DunnettT3法檢驗。

2 結(jié) 果

2.1隱蔽平臺試驗 模型組平均潛伏期下降緩慢而正常組下降明顯，于第2天，組間出現(xiàn)顯著性差異(P=0.016)；模型組平均潛伏期較正常組顯著長，也較假手術組顯著長，但假手術組與正常組無差異；藥線灸組較模型組、非穴組均明顯縮短，而藥物組沒有出現(xiàn)這種顯著性差異。見圖1和表1。

2.2反向試驗 在連續(xù)3 d的反向試驗中，正常組和模型組逃避潛伏期時間均隨訓練天數(shù)的增加而逐漸下

降，再學習成績穩(wěn)步提高，反映針刺治療和水迷宮的訓練顯著性改善再學習和記憶作用(P<0.01)；訓練天數(shù)與組間因素之間沒有交互作用(P>0.05)。各天組間因素兩兩比較發(fā)現(xiàn)：模型組平均逃避潛伏期時間下降緩慢而正常組下降顯著；第4天組間比較出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)，模型組平均逃避潛伏期時間顯著高于正常組(P<0.01)和假手術組(P<0.05)，藥線灸組和藥物組均顯著性低于MID模型組(P<0.05)，而藥線灸組又顯著性低于非穴組(P<0.05)；此后2 d，第6天藥物組與模型組無顯著性差異，表現(xiàn)作用不穩(wěn)定，藥物組和藥線炙組無顯著性差異。見圖1和表1。

圖1 6組隱蔽、反向及可視平臺試驗的平均逃避潛伏期趨勢

2.3空間探索試驗 各組空間探索試驗平均潛伏期有非常顯著性差異(P<0.01)。模型組比正常組穿越原平臺次數(shù)明顯減少(P<0.01)；藥物組雖較模型組能增加穿越原平臺次數(shù)，但無統(tǒng)計學意義；而藥線灸組穿越原象限平臺次數(shù)明顯增加，且分別比模型組、藥物組及非穴組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1和表1。

2.4可視平臺試驗 平均逃避潛伏期時間方面，6組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；平均運動速度方面，6組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1和表1。

表1 6組水迷宮中平均逃避潛伏期時間

與正常組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；與藥線灸非穴組比較：5)P<0.05，6)P<0.01；與藥物組比較：7)P<0.05

3 討 論

VD臨床以認知功能障礙癥候為核心癥狀，兼有一些局灶性神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、神經(jīng)心理癥狀和精神行為異常。動物研究常采用神經(jīng)行為學實驗來檢測這種認知功能狀況。本實驗提示各組大鼠在感覺或運動功能方面均無顯著差異，不對空間學習記憶產(chǎn)生顯著性差異，提示該實驗具有可比性。藥線灸法有療效優(yōu)勢。藥線灸方法較藥物治療是更合適和更優(yōu)選的方法，為進一步深入可能的通過中樞ACh信息傳遞及信號轉(zhuǎn)導的作用機制假說研究提供了鋪墊；藥線灸方法是較西醫(yī)金標準藥物多奈哌齊治療是更佳和更適宜的方法，原因或與壯醫(yī)藥線灸法顯示的多途徑、多靶點和多層次作用有關，綜合改善VD認知功能障礙作用是其取效的關鍵，這正是單一靶點金標準藥物所不具備的，多奈哌齊治療不可避免有其局限性、單一靶點性及副作用。

4 參考文獻

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11Yu J，Liu C，Zhang X，etal.Acupuncture improved cognitive impairment caused by multi-infarct dementia in rats〔J〕.Physiol Behav，2005；86(4)：434-41.