于 洋 趙 寧 張 娜

(錦州醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室，遼寧 錦州 121001)

血管內(nèi)皮細胞功能不全(ECD)已經(jīng)成為2型糖尿病(T2DM)及其血管并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的始動關(guān)鍵因素及病理基礎(chǔ)，并貫穿于整個病程的始終〔1〕。研究表明內(nèi)皮源型一氧化氮(NO)可引起內(nèi)皮依賴性舒張功能，介導(dǎo)血管舒張〔2〕。T2DM造成的氧化應(yīng)激(OS)損傷不但是糖尿病(DM)及血管并發(fā)癥的重要機制，也加速了ECD的發(fā)生發(fā)展〔3〕。六味地黃丸(LWDHP)是著名中成藥，廣泛用于臨床，尤其在高血脂、脂肪肝、T2DM和肥胖等代謝性疾病的防治中突顯優(yōu)勢〔4〕。本實驗通過觀察LWDHP對DM大鼠血管內(nèi)皮舒張功能、NO含量、丙二醛(MDA)濃度及相關(guān)基因蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(PRMT)1表達的影響，探討LWDHP 在DM血管病變中的保護機制。

1 材料與方法

1.1動物 30只雄性SPF級SD大鼠，體質(zhì)量160～190 g，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司〔許可證號：SCXK(遼)2010-0001〕。

1.2主要試劑 LWDHP(濃縮丸)，北京同仁堂(國藥準字Z19993068)；PRMT1一抗，鼠抗人GAPDH一抗，美國Proteintech Group公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔、羊抗鼠IgG二抗，Cell Signaling Technology公司；RT-PCR試劑盒，TaKaRa公司；鏈脲佐菌素(STZ)，Sigma公司；總NO檢測試劑盒，MDA檢測試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所。

1.3T2DM大鼠模型建立及藥物干預(yù) 健康雄性SD大鼠，適應(yīng)性喂食1 w后，隨機分為正常對照組(10只)和造模組(20只)。正常對照組喂食普通飼料，造模組喂食高脂飼料(100 g/L豬油+100 g/L蛋黃粉+1.0 g/L 膽鹽+10 g/L 維生素+789 g/L基礎(chǔ)飼料)。5 w后大鼠禁食不禁水14～16 h，造模組腹腔注射STZ 30 mg/kg(用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配成濃度為10 g/L的STZ溶液)，正常對照組注射等體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，1次/d，連續(xù)2 d。1 w后鼠尾靜脈取血監(jiān)測血糖水平，以兩次隨機血糖≥16.7 mmol/L作為T2DM模型成功的標志，繼續(xù)喂養(yǎng)高脂飼料4 w以穩(wěn)定模型。T2DM模型大鼠隨機分為DM模型組和LWDHP治療組，每組10只。LWDHP治療組給予3 ml/kg的藥物混懸液進行灌胃(用生理鹽水配制，劑量為1.2 g/kg)，正常對照組和DM模型組以等體積生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)灌胃8 w。給藥期間DM模型組與LWDHP治療組大鼠繼續(xù)喂食高脂飼料。8 w后，3組大鼠禁食12 h，斷頭處死。取血管組織，觀察內(nèi)皮依賴性血管舒張功能，檢測NO濃度、MDA含量及PRMT1的表達。

1.4離體胸主動脈內(nèi)皮依賴性血管舒張功能測定 大鼠斷頭處死，迅速打開胸腹腔，取出胸主動脈置于0℃ 的Kreb液(NaCl 119 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，CaCl2·2H2O 2.5 mmol/L，KH2PO41.2 mmol/L，MgSO4·7H2O 1.2 mmol/L，NaHCO325 mmol/L，葡萄糖11.1 mmol/L，pH7.4)中。去除血管周圍的結(jié)締組織和脂肪組織，清除血管內(nèi)的血液，將血管剪切成約3 mm的血管環(huán)。將血管環(huán)懸掛于含8 ml Kreb液(37℃)的浴槽中，持續(xù)通入95% O2+5% CO2的混合氣體。血管環(huán)的一端連接張力換能器，記錄血管環(huán)張力的變化。血管環(huán)的初始張力為2 g，平衡60 min后，加入KCl(使浴槽中終濃度為50 mmol/L)溶液預(yù)刺激2次。血管環(huán)張力平衡后，向浴槽內(nèi)加入1×10-6mol/L的苯腎上腺素收縮血管，判斷血管活性，然后用Kreb液沖洗至基線，血管環(huán)穩(wěn)定后開始實驗，期間每15 min換Krebs液1次，藥物和液體均為直接加入浴液中。用1×10-6mol/L的苯腎上腺素誘發(fā)血管收縮達100%，依次加入終濃度分別為1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5、1×10-4mol/L的乙酰膽堿(ACh)誘導(dǎo)血管舒張，計算舒張百分比(%)= 藥物引起舒張的幅度張力/苯腎上腺素最大收縮張力×100%。沖洗血管，重新平衡到初始張力，改用濃度為10-8～10-4mol/L的內(nèi)皮非依賴性血管舒張劑——亞硝酸鈉(NaNO2)舒張血管，以證明血管內(nèi)皮功能失調(diào)。

1.5離體胸主動脈NO含量和MDA濃度的測定 取整條主動脈約5 cm于液氮中凍存?zhèn)錅yNO含量和MDA濃度，測定時取適量主動脈，加入1∶10冷生理鹽水，勻漿后離心，取上清液，按NO和MDA檢測試劑盒的說明進行操作，測定光密度值，檢測各組血管組織中NO含量和MDA濃度。

1.6RT-PCR測定血管組織中PRMT1 mRNA的表達 提取血管總RNA，用RT-PCR 試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄及聚合酶鏈反應(yīng)。β-actin上游引物序列：5′-ACACGAAAGCAATGCTATCACCTC-3′，下游引物序列：5′-TGACAGCAGTCGGTTGGAGCGA-3′，擴增片段長度153 bp。反應(yīng)條件為94℃ 2 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，72℃ 5 min，40個循環(huán)。PRMT1上游引物序列：5′-GAGGCCGCGAACTGCATCAT-3′，下游引物序列：5′-TGGCTTTGACGATCTTCACC-3′，擴增片段長度350 bp。反應(yīng)條件：退火60℃，30個循環(huán)。通過凝膠成像系統(tǒng)以PRMT1條帶光密度值和對應(yīng)的β-actin條帶光密度值的比值表示PRMT1 mRNA的表達量。

1.7Western印跡測定血管組織中PRMT1蛋白表達 提取血管總蛋白，調(diào)整各組的蛋白質(zhì)上樣量(40 μg)，進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉37℃水浴震蕩封閉1 h，加入PRMT1一抗(1∶500稀釋)，4℃過夜。TBST清洗3次，5 min/次，HRP標記IgG二抗(1∶2 000稀釋)，TBST清洗4次，5 min/次，37℃水浴震蕩2 h，DAB顯色，掃描條帶，以GAPDH作為內(nèi)參，PRMT1和GAPDH蛋白表達強度的灰度比值顯示PRMT1相對表達量。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS20.0統(tǒng)計分析軟件進行單因素方差分析后進行組間LSD分析。

2 結(jié) 果

2.1LWDHP對DM大鼠血管舒張功能的影響 正常對照組，ACh可濃度依賴性舒張苯腎上腺素收縮的血管環(huán)，最大舒張效應(yīng)為(94.50±2.15)%。DM模型組ACh最大舒張反應(yīng)為(61.82±2.34)%，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明動脈的舒張功能出現(xiàn)明顯障礙。LWDHP治療組ACh最大舒張效應(yīng)為(78.66±3.46)%，與DM模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明主動脈對ACh的舒張反應(yīng)較DM模型組明顯增強。各組動脈對內(nèi)皮非依賴性舒張劑NaNO2的最大舒張效應(yīng)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，表明DM模型大鼠血管舒張功能障礙是由于血管內(nèi)皮功能異常導(dǎo)致的。見圖1。

與正常對照組比較：1)P<0.01；與DM模型組比較：2)P<0.01圖1 各組大鼠主動脈對ACh和NaNO2介導(dǎo)的 血管舒張功能的比較

2.2各組動脈組織中NO含量和MDA濃度的測定 DM模型組NO含量明顯降低，MDA濃度明顯增加，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。LWDHP治療組的NO含量升高，MDA濃度下降，與模型組比較顯著有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 LWDHP對血管組織中NO含量和MDA濃度的影響

與正常對照組比較：1)P<0.01；與DM模型組比較：2)P<0.01

2.3LWDHP對血管組織中PRMT1 mRNA表達的影響 與正常對照組(0.33±0.000 9)比較，DM模型組血管組織內(nèi)PRMT1 mRNA的表達量(0.70±0.000 1)顯著升高(P<0.01)。與DM模型組比較，LWDHP治療組PRMT1 mRNA表達量(0.50±0.000 7)明顯下降(P<0.01)，說明LWDHP預(yù)處理可以抑制PRMT1 mRNA的表達量。見圖2。

圖2 各組血管組織PRMT1 mRNA表達的比較

2.4LWDHP對血管組織中PRMT1 蛋白表達的影響 與正常對照組(0.45±0.000 5)比較，DM模型組血管組織內(nèi)PRMT1 蛋白的表達量(0.62±0.000 9)同樣顯著升高(P<0.01)。與DM模型組比較，LWDHP治療組PRMT1蛋白表達量(0.36±0.000 7)同樣下降(P<0.01)，意味著LWDHP同樣也可以抑制PRMT1蛋白的表達。見圖3。

圖3 各組血管組織PRMT1蛋白表達的比較

3 討 論

血管內(nèi)皮細胞(EC)是覆蓋在血管腔內(nèi)表面的高度分化的單層細胞，是血管壁和血液之間的分界細胞。正常的EC可保證血管的反應(yīng)性和血管壁的完整性，是防御DM不良反應(yīng)的第一道防線，而DM患者血管內(nèi)皮損傷是疾病發(fā)生發(fā)展的首發(fā)因素〔5〕。本實驗觀察到，T2DM大鼠的胸主動脈對ACh的血管舒張反應(yīng)較正常對照組明顯降低，提示DM大鼠的內(nèi)皮依賴性血管舒張功能存在障礙。采用LWDHP灌胃治療的大鼠胸主動脈對ACh的血管舒張反應(yīng)增加，表明內(nèi)皮依賴性血管舒張功能得以改善。三組大鼠對內(nèi)皮非依賴性舒張劑NaNO2的血管舒張反應(yīng)無明顯差異，說明LWDHP治療組和DM模型大鼠胸主動脈對外源性NaNO2擴血管的反應(yīng)是相同的，即DM并沒有降低血管平滑肌細胞對NO的敏感性，另一方面也證實了LWDHP并不是通過增加血管平滑肌細胞對NO的敏感性來發(fā)揮其改善血管舒張功能的。這一結(jié)果提示LWDHP 可保護DM大鼠的血管EC，改善DM所致的內(nèi)皮依賴性血管舒張功能障礙。

NO是一種內(nèi)皮源性信號分子，能引起內(nèi)皮依賴性舒張功能，介導(dǎo)血管舒張。實驗發(fā)現(xiàn)〔6〕，輸注胰島素后實驗動物下肢血流量較基礎(chǔ)值增加了2倍，但加用抑制劑后血管舒張作用消失，提示胰島素的血管舒張作用是NO依賴性，而且胰島素是通過增加內(nèi)皮源性NO的釋放來實現(xiàn)血管舒張功能的。培養(yǎng)的EC實驗也證明胰島素抵抗的細胞裂解液中NO含量釋放減少〔7〕。本實驗結(jié)果顯示，DM模型組血管組織中NO含量明顯降低，而LWDHP能增加NO含量，進一步證實LWDHP對DM內(nèi)皮損傷的改善作用，提示LWDHP對血管內(nèi)皮的保護作用與其能夠促進血管內(nèi)皮NO的生成有著密切關(guān)系。

高糖環(huán)境下體內(nèi)的OS反應(yīng)增強，使體內(nèi)的活性氧大量積聚，從而促進DM及其他血管并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。同時，在氧自由基的攻擊下膜脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，最重要的終產(chǎn)物之一MDA也增加〔8〕。因此， MDA含量的變化可間接反映氧自由基的生成量，從而了解氧自由基對細胞損傷的程度。另外，DM發(fā)生發(fā)展過程中的OS反應(yīng)導(dǎo)致的大量活性氧可以催化一種關(guān)鍵酶——PRMT1酶的活化，它可以催化一種新的心血管疾病的危險因子——非對稱二甲基精氨酸(ADMA)的生成〔9〕。ADMA是內(nèi)皮源型一氧化氮合酶(eNOS)的競爭抑制劑，可以降低其活性，降低NO的合成。當eNOS的底物L(fēng)-精氨酸的活性缺乏時，此時的L-精氨酸在eNOS的作用下能產(chǎn)生更多的活性氧自由基，加重OS反應(yīng)〔10〕。本實驗中，DM模型組血管組織中MDA濃度明顯增加，PRMT1 mRNA和蛋白的表達量顯著升高，證明了活性氧可使PRMT1進一步增多，最終使NO合成減少，進一步惡化ECD，這樣就可能形成一個加重OS反應(yīng)的惡性循環(huán)。同時也檢測到LWDHP治療后MDA濃度下降，PRMT1 mRNA和蛋白的表達量顯著降低，揭示了LWDHP可以抑制PRMT1表達、降低OS損傷，改善受損的EC狀態(tài)，增加胰島素敏感性，從而延緩DM及其血管并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。

既然PRMT1酶作用的底物是ADMA，ADMA又是eNOS的競爭抑制劑，而且eNOS是NO合成的關(guān)鍵酶，那么在DM及血管并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的EC氧化損傷的這條通路中，LWDHP對DM大鼠血管組織中ADMA的生成和eNOS的表達是否有影響，還需進一步研究。

4 參考文獻

1Al-Jiffri OH,Al-Sharif FM,Al-Jiffri EH,etal.Intrinsic disorder in biomarkers of insulin resistance,hypoadiponectinemia,and endothelial dysfunction among the type 2 diabetic patients〔J〕.Intrinsically Disord Proteins,2016;4(1):e1171278.

2Yu FTH,Chen X,Straub AC,etal.The role of nitric oxide during sonoreperfusion of microvascular obstruction〔J〕.Theranostics,2017;7(14):3527-38.

3Klisic A,Isakovic A,Kocic G,etal.Relationship between oxidative stress,inflammation and dyslipidemia with fatty liver index in patients with type 2 diabetes mellitus〔J〕.Exp Clin Endocrinol Diabetes，2017;〔Epub ahead of print〕.

4房 玲，樊永平，王 蕾.六味地黃丸(湯)的臨床應(yīng)用研究〔J〕.中華中醫(yī)藥雜志，2013;28(7):2181-5.

5Kang H,Ma X,Liu J,etal.High glucose-induced endothelial progenitor cell dysfunction〔J〕.Diab Vasc Dis Res,2017;14(5):381-94.

6Bradley EA,Willson KJ,Choi-Lundberg D,etal.Effects of central administration of insulin or l-NMMA on rat skeletal muscle microvascular perfusion〔J〕.Diabetes Obes Metab,2010;12(10):900-8.

7于 洋,趙丹玉,王艷杰,等.軟脂酸對EA.hy926細胞一氧化氮合成的影響及六味地黃丸的干預(yù)效應(yīng)〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2014;34(6):1583-5.

8Kim CH.Expression of extracellular superoxide dismutase protein in diabetes〔J〕.Arch Plast Surg,2013;40(5):517-21.

9Servillo L,Giovane A,Cautela D,etal.The methylarginines NMMA,ADMA,and SDMA are ubiquitous constituents of the main vegetables of human nutrition〔J〕.Nitric Oxide,2013;30:43-8.

10Goette A,Hammwohner M,Bukowska A,etal.The impact of rapid atrial pacing on ADMA and endothelial NOS〔J〕.Int J Cardiol,2012;154(2):141-6.