宋 銳 袁金金 侯 歌 楊 軍 陳曉娟 劉宗文

(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤放療科，河南 鄭州 450014)

乳腺癌發(fā)病率在全部惡性腫瘤中占10%左右，在女性惡性腫瘤中位居第二位，僅次于子宮癌〔1〕。乳腺癌誘發(fā)原因較多，遺傳、生活環(huán)境等均與乳腺癌的發(fā)生有關(guān)，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，是多種基因共同作用的結(jié)果。目前常見的治療乳腺癌的方法有手術(shù)治療、放化療。由于大多數(shù)患者在確診時已經(jīng)是乳腺癌的中晚期，放療成為治療乳腺癌的重要輔助手段〔2〕。提高乳腺癌放療敏感性成為目前研究的熱點。P21激活的蛋白激酶(PAK)6在肺癌、前列腺癌、舌鱗癌、胰腺癌等癌組織中過度表達(dá)，能夠促進(jìn)腫瘤發(fā)生〔3～5〕。研究表明，抑制PAK6表達(dá)后，能夠促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，抑制癌癥發(fā)展〔6〕。Wnt信號通路參與腫瘤發(fā)展，在腫瘤組織中過度激活，其關(guān)鍵基因β-連環(huán)蛋白(catenin)和下游靶基因c-myc均表達(dá)升高，并且參與癌基因和抑癌基因?qū)Π┌Y的調(diào)控過程〔7〕。本研究旨在探討PAK6對乳腺癌細(xì)胞放療敏感性和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞 乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2主要儀器及試劑 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒、組織蛋白提取試劑盒均購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；PAK6小干擾RNA(siRNA)和陰性對照序列(siRNA對照)購自上海吉瑪生物科技有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；β-catenin單克隆抗體、c-myc單克隆抗體、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(酶切Caspase)-3單克隆抗體均購自美國Cell Signaling Technology ；流式細(xì)胞儀購自美國BD。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞轉(zhuǎn)染 乳腺癌細(xì)胞用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，觀察細(xì)胞密度生長至90%時，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的乳腺癌細(xì)胞，消化后，種植到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(每孔106個細(xì)胞)培養(yǎng)，觀察細(xì)胞密度達(dá)到60%時，將細(xì)胞培養(yǎng)液換成不含胎牛血清的不完全培養(yǎng)液，放在37℃孵育60 min。用Lipofectamine 2000將PAK6 siRNA組和siRNA對照組轉(zhuǎn)染至乳腺癌細(xì)胞中，以未轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞為對照，放在37℃培養(yǎng)48 h后，Western印跡和qRT-PCR檢測細(xì)胞中PAK6水平。

1.4qRT-PCR檢測PAK6表達(dá) 取1.3中轉(zhuǎn)染后48 h的細(xì)胞，加入Trizol裂解液混合充分裂解后，加入Trizol裂解液1/5體積的三氯甲烷，劇烈震蕩15 s，放在室溫環(huán)境下靜置15 min，12 000 r/min，4℃離心20 min，吸取水相層至EP管中，加入Trizol裂解液1/2體積的異丙醇，混合后，靜置10 min，12 000 r/min，4℃離心20 min，加入乙醇洗滌兩次，晾干后，用紫外分光光度計檢測提取的RNA濃度及純度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成PAK6 cDNA，qRT-PCR試劑盒檢測PAK6 mRNA水平。內(nèi)參基因為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)。根據(jù)2-△△Ct法計算PAK6水平?！鰿t=PAK6 Ct值-GAPDH Ct值。反應(yīng)程序為：95℃ 3 min，95℃ 15 s，58℃ 1 min重復(fù)40個循環(huán)，72℃ 7 min。PAK6上游引物為5′-CCGAATTCATGTTTGGGAAGAAAAAGAA-3′，下游引物5′-ATCTCGAGTCGAGAGGCTGCTCTCTGATACTCC-3′。GAPDH上游引物為5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′，下游引物5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′。

1.5Western印跡檢測PAK6表達(dá) 取1.3中轉(zhuǎn)染后48 h的細(xì)胞，提取細(xì)胞中的總蛋白，BCA定量檢測試劑盒檢測蛋白濃度。取蛋白樣品，加入等體積的2×加樣緩沖液混合后，放在100℃中煮沸5 min使蛋白變性。將變性蛋白樣品加入到上樣孔中，每孔加入50 μl的蛋白樣品，電泳初始電壓為80 V，電泳30 min后，120 V至電泳結(jié)束。將蛋白凝膠取出后，放在緩沖液中浸泡10 min。將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，轉(zhuǎn)膜條件為：100 mA。用5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉30 min后，加入一抗(800倍稀釋，4℃孵育過夜)、二抗(1 000倍稀釋，室溫下孵育60 min)依次反應(yīng)后，曝光，以GAPDH為內(nèi)參，分析蛋白表達(dá)水平。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取轉(zhuǎn)染48 h后的乳腺癌細(xì)胞，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，胰蛋白酶消化后，收集3×106個細(xì)胞，冰預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸細(xì)胞兩次，加入結(jié)合緩沖液200 μl重懸細(xì)胞，各加入5 μl碘化丙啶(PI)和膜聯(lián)蛋白(V-FITC)，充分混勻后放在避光環(huán)境中，室溫靜置15 min，加入300 μl的緩沖液，用流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.7細(xì)胞克隆實驗 取處于對數(shù)生長期且轉(zhuǎn)染48 h后的乳腺癌細(xì)胞，胰蛋白酶消化后，離心，棄酶消化液，接種至12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入105個細(xì)胞，放在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁后，分別用0、2、4、6、8 Gy劑量照射細(xì)胞(照射條件為：200 kV，10 mA，劑量率為0.287 Gy/min)，培養(yǎng)12 d。肉眼觀察細(xì)胞克隆形成后，棄上清液，加入PBS洗滌細(xì)胞3次，甲醇固定30 min，結(jié)晶紫染色20 min，用自來水小心沖洗染液，在室溫下干燥。顯微鏡下觀察細(xì)胞形成的克隆數(shù)，擬合劑量存活曲線。

1.8Western印跡檢測細(xì)胞中β-catenin、c-myc、酶切Caspase-3蛋白表達(dá) 取對數(shù)生長期轉(zhuǎn)染后的乳腺癌

細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，Western印跡檢測細(xì)胞中β-catenin、c-myc、酶切Caspase-3蛋白表達(dá)。

1.9統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.13組PAK6表達(dá) PAK6 siRNA組細(xì)胞中的PAK6 mRNA和蛋白水平均明顯低于未轉(zhuǎn)染組(P<0.01)。siRNA對照組PAK6 mRNA和蛋白水平與未轉(zhuǎn)染組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。PAK6 siRNA能夠干擾乳腺癌細(xì)胞中PAK6的表達(dá)。見圖1，表1。

圖1 Western印跡檢測轉(zhuǎn)染后乳腺癌細(xì)胞中PAK6表達(dá)

組別PAK6 mRNAPAK6 蛋白未轉(zhuǎn)染組1.00±0.111.32±0.08siRNA對照組1.01±0.091.34±0.14PAK6 siRNA組0.45±0.071)0.34±0.051)

與未轉(zhuǎn)染組相比：1)P<0.01

2.2各組細(xì)胞凋亡影響比較 PAK6 siRNA組細(xì)胞凋亡率〔(36.41±4.75)%〕與未轉(zhuǎn)染組〔(11.66±1.67)%〕相比明顯升高(P<0.01)。siRNA對照組細(xì)胞凋亡率〔(11.36±1.85)%〕與未轉(zhuǎn)染組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。干擾PAK6 表達(dá)能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡。

圖2 干擾PAK6對乳腺癌細(xì)胞凋亡影響

2.3各組細(xì)胞放療敏感性比較 PAK6 siRNA組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)(SF2)降低，放療增敏比為：1.896。干擾PAK6能夠增加乳腺癌細(xì)胞放療敏感性。見表2。

2.4各組β-catenin、c-myc、酶切Caspase-3表達(dá) PAK6 siRNA組與未轉(zhuǎn)染組比較，β-catenin、c-myc表達(dá)顯著降低，酶切Caspase-3表達(dá)顯著升高(均P<0.01)。見表3，圖3。

表2 單擊多靶模型參數(shù)值

圖3 Western印跡檢測干擾PAK6后乳腺癌細(xì)胞中 β-catenin、c-myc、酶切Caspase-3蛋白表達(dá)

組別β-cateninc-myc酶切Caspase-3未轉(zhuǎn)染組0.58±0.070.64±0.050.32±0.06siRNA對照組0.59±0.060.65±0070.31±0.08PAK6 siRNA組0.15±0.061)0.18±0.061)0.99±0.111)

與未轉(zhuǎn)染組相比：1)P<0.01

3 討 論

PAK是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，哺乳動物含有6個亞型，在細(xì)胞形態(tài)維持、骨架支撐等方面具有調(diào)控作用〔8〕。研究表明，PAK6參與癌癥的發(fā)展，在癌癥組織中表達(dá)上調(diào)，能夠調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡等過程〔9〕。Gao等〔10〕在皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織中發(fā)現(xiàn)，PAK6 mRNA的表達(dá)水平是正常組織的2倍。Chen等〔11〕通過免疫組化發(fā)現(xiàn)，PAK6在子宮內(nèi)膜癌組織和正常內(nèi)膜組織中的陽性表達(dá)率分別為46.88%和22.5%。Mitsudomi等〔12〕通過轉(zhuǎn)染PAK6 siRNA發(fā)現(xiàn)，干擾PAK6表達(dá)后能夠抑制非小細(xì)胞肺癌侵襲，細(xì)胞侵襲能力約為原來細(xì)胞的一半。隨著研究的不斷深入，在結(jié)腸癌、胃癌、原發(fā)性肝癌等癌組織中均發(fā)現(xiàn)有PAK6表達(dá)異常升高〔13〕。本研究在體外以乳腺癌細(xì)胞為研究對象，通過轉(zhuǎn)染PAK6小干擾RNA進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，干擾PAK6表達(dá)后能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的凋亡，并且能夠增加乳腺癌細(xì)胞放療敏感性。溫星橋等〔14〕發(fā)現(xiàn)，干擾前列腺癌細(xì)胞株LNCaP中PAK6表達(dá)后能夠促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的凋亡。Zhang等〔15〕研究表明，干擾PAK6后能夠增加前列腺癌細(xì)胞的放療敏感性，促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡。這些研究結(jié)果均說明，干擾PAK6能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡，增加癌細(xì)胞的放療敏感性。

細(xì)胞凋亡是一個復(fù)雜的過程，受到多種基因的嚴(yán)格調(diào)控，是一系列反應(yīng)共同作用的結(jié)果。Caspase-3是Caspase蛋白家族的成員之一，是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行因子，Caspase-3活化后，酶切Caspase-3表達(dá)升高，細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆階段〔16〕。研究表明，多種抑癌基因和癌基因能夠通過調(diào)控Caspase-3的活化而干擾癌細(xì)胞凋亡過程〔17〕。本研究結(jié)果說明，干擾PAK6能夠通過作用于酶切Caspase-3而影響乳腺癌細(xì)胞的凋亡過程。

Wnt基因是從乳腺癌小鼠中克隆出來的一種癌基因，能夠促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，目前發(fā)現(xiàn)的有19個亞型，Wnt信號通路是一個較為復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，由多個作用位點和多個環(huán)節(jié)共同組成〔18〕。經(jīng)典的Wnt信號通路與β-catenin有關(guān)，β-catenin能夠與其他蛋白分子結(jié)合形成復(fù)合物，在外界因素的作用下，β-catenin能夠調(diào)控相關(guān)蛋白的表達(dá)〔19，20〕。c-myc是Wnt信號通路的下游靶基因，Wnt信號通路激活后能夠促進(jìn)c-myc的表達(dá)〔21〕。Cleary等〔22〕在乳腺癌中有Wnt信號通路的異常激活。冬凌草甲素能夠調(diào)控Wnt信號通路影響乳腺癌MCF-7細(xì)胞的生物學(xué)特性〔23〕。 本研究結(jié)果提示，干擾PAK6能夠抑制乳腺癌細(xì)胞中Wnt信號通路的激活。

綜上所述，干擾PAK6表達(dá)能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡，增加乳腺癌細(xì)胞放療敏感性，作用機(jī)制可能與抑制Wnt信號通路的激活有關(guān)。本研究只用了一種乳腺癌細(xì)胞，且只在體外進(jìn)行了相關(guān)研究，后續(xù)會繼續(xù)在體內(nèi)和體外繼續(xù)研究PAK6對其他幾種乳腺癌細(xì)胞凋亡及放療敏感性的影響。

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