謝達飛 袁佩文

(浙江醫(yī)院普外科，浙江 杭州 310013)

原發(fā)性肝癌的主要治療方法為以手術(shù)為主的綜合治療，原發(fā)性肝癌惡性程度比較高，對放化療不敏感，手術(shù)切除后復(fù)發(fā)率比較高，隨著細胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和人類基因組學(xué)等學(xué)科的不斷發(fā)展，基因免疫治療在原發(fā)性肝癌治療中的作用越來越受到重視，基因免疫治療有可能成為原發(fā)性肝癌的有效治療方法〔1，2〕，以樹突細胞為基礎(chǔ)的免疫治療在肝癌的免疫治療中的作用越來越受到關(guān)注〔3，4〕，通過腫瘤細胞負載樹突細胞制備疫苗在原發(fā)性肝癌中的研究取得一定效果。樹突細胞特異性細胞間黏附分子3結(jié)合的非整合素(DC-SIGN)是樹突細胞的C型凝集素的主要成員，是一種多功能免疫分子，在腫瘤的免疫逃逸和免疫應(yīng)答等方面發(fā)揮重要作用〔5，6〕，DC-SIGN在腫瘤免疫逃逸和免疫反應(yīng)中為腫瘤的基因免疫治療提供新思路，但DC-SIGN在原發(fā)性肝癌發(fā)病中的作用尚不十分清楚。本文對原發(fā)性肝癌組織中DC-SIGN的表達及臨床意義進行研究。

1 材料與方法

1.1材料 選擇浙江醫(yī)院普外科2013年1月至2015年12月原發(fā)性肝癌患者手術(shù)切除的肝癌組織標本30例及對應(yīng)的距離肝癌組織2 cm以上的癌旁肝組織標本30例。30例肝癌患者年齡(48.36±11.24)歲；男25例，女5例；有包膜17例，無包膜或包膜不完整13例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期21例，Ⅲ～Ⅳ期9例；中高分化20例，低未分化10例；腫瘤<5 cm者19例，≥5 cm者11例；有靜脈侵犯者13例，無靜脈侵犯者17例。納入標準：所有患者經(jīng)病理證實為原發(fā)性肝癌，簽署知情同意書，經(jīng)倫理委員會審批。主要試劑：兔抗人DC-SIGN抗體、鼠抗人DC-SIGN單克隆抗體、兔抗鼠β-actin抗體、山羊抗兔二抗(美國R&D公司)，檸檬酸鹽緩沖粉末、過氧化氫水、蘇木素、封閉血清(北京中山金橋生物科技公司)，DC-SIGN引物、GAPDH引物、RT-PCR試劑盒(美國Invitrogen.Inc)等。

1.2肝癌組織和癌旁組織中DC-SIGN蛋白表達檢測 取肝癌組織和癌旁組織石蠟塊，4 μm厚，放入烤箱烤片30 min，脫蠟、水化、沖洗后，將切片放入沸騰的檸檬酸鹽緩沖液進行抗原修復(fù)，將切片放入過氧化氫去離子水中孵育30 min清除內(nèi)源性過氧化物酶，沖洗、封閉，加入一抗兔抗人DC-SIGN抗體，空白對照不加一抗，過夜孵育，沖洗后加入山羊抗兔抗體二抗孵育，沖洗、顯色，加入蘇木素復(fù)染，脫水封片，每張肝癌組織和癌旁組織隨機選5個視野，高倍鏡下拍照，采用IPP軟件計算光密度值，免疫組化DC-SIGN蛋白表達量以平均光密度值表示。

1.3肝癌組織和癌旁組織中DC-SIGN mRNA表達測定 提取肝癌組織和癌旁組織標本總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板采用RT-PCR法測定肝癌組織和癌旁組織中DC-SIGN mRNA水平，以β-actin為內(nèi)參，RT-PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2 min，94℃30 s、55℃1 min、72℃1 min，共30個循環(huán)，72℃延伸1 min。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)分析軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1肝癌組織和癌旁組織中DC-SIGN蛋白的表達 肝癌組織中DC-SIGN蛋白光密度值明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=181.289，P=0.000)。

2.2肝癌組織和癌旁組織中DC-SIGN mRNA的表達 肝癌組織中DC-SIGN mRNA相對表達量(1.63±0.34)明顯高于癌旁組織(1.00±0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.145，P=0.000)。

2.3肝癌組織DC-SIGN蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系 肝癌組織DC-SIGN蛋白表達與肝癌包膜、TNM分期、血清甲胎蛋白(AFP)水平有關(guān)(P<0.05)，與肝癌患者的年齡、性別、組織分化、腫瘤大小、靜脈侵犯無關(guān)(P>0.05)。見表1。

2.4肝癌組織DC-SIGN mRNA表達與臨床病理特征的關(guān)系 肝癌組織DC-SIGN mRNA表達與肝癌包膜、TNM分期、血清AFP水平有關(guān)(P<0.05)，與肝癌患者的年齡、性別、組織分化、腫瘤大小、靜脈侵犯無關(guān)(P>0.05)。見表2。

表1 肝癌組織DC-SIGN蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系

表2 肝癌組織DC-SIGN mRNA表達與臨床病理特征的關(guān)系

3 討 論

樹突細胞可通過其表面抗原受體參與T細胞的激活、增殖和分化而引起機體免疫應(yīng)答，也可通過與腫瘤細胞或病原體相互作用使腫瘤細胞或病原體產(chǎn)生免疫逃逸；樹突細胞的免疫調(diào)節(jié)作用和樹突細胞表面的受體分子有關(guān)，其表面的分子受體主要有C型凝集素受體和Toll樣受體兩大家族，DC-SIGN為樹突細胞C型凝集素受體的主要成員，是一種具有多種功能的免疫分子，在樹突細胞的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用〔7，8〕。DC-SIGN是一種Ⅱ型跨膜蛋白質(zhì)，分為胞質(zhì)區(qū)、跨膜區(qū)和胞外區(qū)，由404個氨基酸組成，胞質(zhì)區(qū)調(diào)節(jié)抗原內(nèi)化過程，并參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；跨膜區(qū)參與DC-SIGN在細胞膜上定位；胞外區(qū)有頸結(jié)構(gòu)域和糖識別域組成，頸結(jié)構(gòu)域參與DC-SIGN與糖配體結(jié)合，糖識別域可識別并結(jié)合糖類抗原〔9，10〕。

DC-SIGN在樹突細胞的遷移、激活T細胞、炎癥反應(yīng)、啟動免疫應(yīng)答、腫瘤細胞及病原體的免疫逃逸及免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用〔11，12〕。在正常細胞惡變的過程中，隨著細胞表面分子的異常糖基化，DC-SIGN對糖基進行識別，在腫瘤抗原的呈遞過程中發(fā)揮作用；DC-SIGN可識別腫瘤細胞特異性抗原相關(guān)細胞黏附分子，從而介導(dǎo)非成熟樹突細胞對腫瘤細胞內(nèi)化攝入，從而發(fā)生免疫逃逸〔13，14〕。DC-SIGN還參與多種微生物感染〔15〕，高甘露糖結(jié)構(gòu)可被高表達DC-SIGN的未成熟樹突細胞識別，從而對其內(nèi)攝，發(fā)生免疫逃避。腫瘤細胞存在病原體類似的機制，在結(jié)腸癌中也存在DC-SIGN高表達現(xiàn)象，DC-SIGN在結(jié)腸癌中可能也參與結(jié)腸癌的免疫逃逸〔16〕。本研究表明DC-SIGN參與原發(fā)性肝癌的發(fā)生發(fā)展，在無包膜或包膜不完整肝癌組織中DC-SIGN表達量比較高，在肝癌分期比較高的肝癌組織中DC-SIGN表達量也比較高。DC-SIGN在原發(fā)性肝癌組織中的作用機制尚不清楚，是否與免疫逃逸有關(guān)尚需進一步研究。

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