包 明 何紅霞 馬小龍 王朝輝 邱煒紅

（農(nóng)業(yè)部西北植物營養(yǎng)與農(nóng)業(yè)環(huán)境重點實驗室/西北農(nóng)林科技大學資源環(huán)境學院，陜西楊凌 712100）

施用化學氮肥對糧食產(chǎn)量的提高起著重要的作用，是提高農(nóng)作物產(chǎn)量最迅速、最有效的方法之一。據(jù)聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織（FAO）統(tǒng)計［1］，全球化學氮肥2015年消費總量達到N 1.09×108t，其中中國消費3.10×107t，占全球總消費的28.5%，較1978年的7.5×106t 增加3.15倍?；瘜W氮肥在增加糧食產(chǎn)量的同時，亦對全球環(huán)境如溫度（溫室效應［2］）、土壤（酸化［3］）、生態(tài)環(huán)境（面源污染［4］）等方面產(chǎn)生重要影響。此外，長期大量的化學氮肥施用對土壤物理、化學、生物性質產(chǎn)生影響［5-9］，進而影響到土壤微生物群落多樣性。有研究表明，長期化學氮肥施用降低了旱地土壤真菌的豐度和多樣性［10］，增加了水稻土細菌的豐度和多樣性［11-12］，同時也改變了不同生態(tài)系統(tǒng)的細菌和真菌群落結構［10,13］。

綠肥是一種養(yǎng)分完全的生物肥源，也是目前化學肥料零增長計劃和土壤有機質提升計劃的重要替代肥源，對農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展有著重要意義。研究表明，綠肥可促進后茬作物（小麥）生長并提高產(chǎn)量，提供大量的碳源和養(yǎng)分，改善土壤物理、化學和生物學性狀，緩解化肥資源緊張并節(jié)約化肥投入成本［14］。同時，綠肥也改變了土壤細菌多樣性及群落組成［15］。

黃土高原旱地是我國西北地區(qū)重要的耕地資源，但土壤全氮含量和有機質含量相對較低，其中有機質含量平均值僅有1.1%［16］，且超過1/2的土壤有機質含量低于1%。在此條件下，為了提高作物產(chǎn)量，化學氮肥往往會過量施用［17］，利用綠肥部分替代化肥既可以培肥又可以改善土壤性質和替代部分化肥［14］，是提高作物產(chǎn)量的重要措施之一。但在此區(qū)域，關于長期化學氮肥和綠肥施用對土壤的生化性質、微生物多樣性及其功能的研究相對較少。因此，本研究基于8年的定位試驗，利用高通量測序技術研究分析了化學氮肥和綠肥施用對土壤細菌多樣性及其功能的影響，以期為該區(qū)域旱地土壤肥料管理提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗地位于渭北旱塬雨養(yǎng)農(nóng)業(yè)區(qū)陜西省長武縣丁家鎮(zhèn)十里鋪村（35°12′N，107°45′E，海拔1 200 m）。該地區(qū)年均氣溫9.1℃，年均降水量579 mm，降水主要集中在7—9月，占全年降水量的50%～60%。試驗區(qū)地勢平坦，供試土壤為黑壚土，母質為中壤質馬蘭黃土。定位試驗開始時耕層土壤（0～20 cm）基本理化性質為：pH 8.17、容重1.35 g cm-3、有機碳8.52 g kg-1、全氮0.78 g kg-1、硝態(tài)氮13.1 mg kg-1、有效磷（Olsen-P）4.5 mg kg-1、速效鉀129.6 mg kg-1。

1.2 試驗設計

試驗開始于2008年9月，以冬小麥為研究作物，一年一季，于9月底播種、翌年6月底收獲。設置3個處理：對照（CK）、化學氮肥（FP）、氮肥+綠肥（FGM）。其中CK處理僅施過磷酸鈣（P2O5105 kg hm-2a-1），F(xiàn)P處理施用尿素（N 150 kg hm-2a-1）與過磷酸鈣（P2O5105 kg hm-2a-1），F(xiàn)GM處理化肥施用量同F(xiàn)P，并于小麥收獲后不施肥硬茬播種綠肥（大豆，地方品種），播種量75 kg hm-2，下季小麥播前2周將綠肥打碎后翻壓入土壤，耕深為30 cm。所有處理的秸稈在冬小麥收獲后移出小區(qū)，不還田。冬小麥品種為長武521，播種密度為150 kg hm-2，行距20 cm。小區(qū)面積 6 m×22 m=132 m2。每處理重復4次，采用完全隨機區(qū)組試驗設計。冬小麥整個生育期不灌水，田間管理與當?shù)剞r(nóng)戶一致。

1.3 樣品采集與分析

于2016年9月18日小麥播種前隨機選取各處理3個區(qū)組，按五點采樣法采集耕層0～20 cm的土樣，混勻后立即帶回實驗室，去除根系等雜物后分為3部分：一部分土樣作為鮮土用來測定土壤微生物生物量碳、微生物生物量氮、可溶性有機碳、可溶性有機氮、土壤礦質氮（硝態(tài)氮和銨態(tài)氮）；一部分–80 ℃冷凍保存用于測定細菌多樣性；一部分土樣經(jīng)過風干后過篩，用于土壤理化性質測定。土壤pH、有機碳、礦質氮采用常規(guī)方法測定［18］。土壤微生物生物量氮、微生物生物量碳采用氯仿熏蒸-K2SO4提取法測定［19-20］?？扇苄杂袡C氮、可溶性有機碳采用0.5 mol L-1K2SO4提取后利用碳自動分析儀、流動分析儀測定。

1.4 DNA提取及高通量測序

稱取0.3 g土壤樣品，采用C TA B改進方法對土壤樣本基因組D N A進行提取，之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測D N A的純度和濃度，取適量的樣品于離心管中，使用無菌水稀釋樣品至1 mgL-1。以稀釋后的基因組DNA為模板，使用帶B a r c o d e的特異引物（5 1 5 F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′），利用Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer（New England Biolabs公司）和高效高保真酶對細菌V4區(qū)進行PCR。PCR反應程序為98 ℃預變性1 min；30個循環(huán)為（98 ℃，10 s；50 ℃，30 s；72 ℃，30 s）；然后72 ℃，延伸5 min（所用儀器為Bio-rad T100梯度PCR儀）。PCR產(chǎn)物使用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，然后根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進行等量混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，對目的條帶使用膠回收試劑盒（Qiagen公司）回收產(chǎn)物。使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit（Illumina公司）建庫試劑盒進行文庫構建，經(jīng)Qubit和Q-PCR定量合格后，使用HiSeq2500 PE250進行上機測序（委托北京諾禾致源科技股份有限公司測定）。

1.5 數(shù)據(jù)處理

測序后的序列按照標準方法處理后，利用Uparse軟件（Uparse v7.0.1001）對樣品有效序列進行聚類，以97%的一致性將序列聚類成為OTU（基本分類單元）。然后對OTU序列進行物種注釋，用Mothur方法與SILVA（Release128，http://www.arb-silva.de/）的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進行物種注釋分析，獲得分類學信息并分別在各個分類水平統(tǒng)計各樣本的群落組成。然后利用Qiime軟件（Version 1.7.0）計算基本分類單元數(shù)、豐度指數(shù)（Chao1指數(shù)）和多樣性指數(shù)（Shannon指數(shù)），利用R軟件（Version 3.2.5）和相關軟件包進行細菌群落組間差異分析（主坐標分析、非度量多維尺度分析和Anosim分析）、組間差異物種分析和細菌功能預測分析（FAPROTAX（http://www.zoology.ubc.ca/louca/FAPROTAX）、Tax4Fun（http://tax4fun.gobics.de/））。其他數(shù)據(jù)采用Excel 2016、DPS（v7.05）進行處理分析，多重比較采用LSD法，顯著性水平為α=0.05。

2 結 果

2.1 土壤生物化學性質

化學氮肥和綠肥施用對旱地麥田土壤性質有不同影響（表1）。與對照（CK）相比，化學氮肥處理（FP）僅顯著增加了土壤有機碳含量（8.0%），而對其他土壤性質均無顯著性影響。氮肥+綠肥處理（FGM）顯著增加了土壤有機碳（20.0%）、微生物生物量碳（62.0%）、微生物生物量氮（35.9%）、可溶性有機碳（7.27%）和可溶性有機氮（56.3%）含量，而對土壤硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量無顯著性影響。

表1 不同處理條件下土壤生物化學性質Table 1 Biochemical properties of the soil relative to treatment

2.2 細菌群落豐度與多樣性

高通量測序后獲得691 724條有效序列，CK、FP和FGM處理的平均有效序列分別為76 689、80 774、73 112。經(jīng)過與數(shù)據(jù)庫比對注釋后，共獲得34 134個OTU（基本分類單元），CK、FP和FGM的平均OTU數(shù)為3 792，各處理之間無顯著性差異（表2）。細菌群落豐度指數(shù)（Chao1）和多樣性指數(shù)（Shannon）各處理之間均無顯著性差異。說明與對照相比，化學氮肥和綠肥施用并未顯著改變細菌群落豐度及多樣性。

表2 不同處理細菌群落豐度與多樣性指數(shù)Table 2 Bacterial community richness （OTU number） and diversity indices （Chao1, Shannon） relative to treatment

2.3 細菌群落組成與群落結構

細菌1 6 S r D N A 高通量測序序列經(jīng)物種注釋后共獲得49個門、101個綱、200個目、3 6 0個科和5 5 2個屬類細菌。在門和屬水平上，細菌群落組成如圖1所示?？梢钥闯鲈陂T水平，C K、F P和F G M處理的相對豐度＞1%的細菌分別占總細菌總數(shù)的95.0%、94.5%和94.3%。CK、FP和FGM各處理的菌群相對豐度無顯著性差異，其中優(yōu)勢菌群為變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）和擬桿菌門（Bacteroidetes），各處理的平均相對豐度分別為35.6%、18.6%、12.6%、7.2%和6.7%。在屬水平上，CK、FP和FGM各處理相對豐度≥0.5%的屬占總細菌屬的15.6%、13.3%和13.8%，其中優(yōu)勢細菌屬為鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、乳酸菌屬（Lactobacillus）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、Haliangium和Gaiella，各處理平均相對豐度分別為3.5%、0.8%、1.1%、1.2%和0.9%。這些優(yōu)勢菌群屬中，僅有乳酸菌屬（Lactobacillus）在CK、FP和FGM處理中存在顯著性差異，即FGM處理顯著低于CK和FP處理。此外，有部分其他細菌屬（相對豐度＜0.5%）在CK、FP、FGM處理之間存在著顯著性差異（表3），說明化學氮肥和綠肥施用顯著改變了土壤細菌在屬水平上的群落組成。但從整體來看，排序分析（圖2）和Anosim分析（p（CK-FP）=1；p（CK-FGM）=1；p（FP-FGM）=0.7）均表明CK、FP、FGM處理之間的細菌群落結構并無顯著性差異，說明化學氮肥和綠肥施用并未改變土壤的細菌群落結構。

圖1 不同處理條件下土壤細菌在門水平（A）和屬水平（B）上的優(yōu)勢物種豐度圖Fig. 1 Dominant species abundance map at the phylum（A） and genus （B）levels relative to treatment

表3 不同處理間相對豐度達到差異顯著的細菌屬（相對豐度＞0.1%）列表Table 3 List of soil bacterial genera （with abundance ＞ 0.1%） with significant difference between treatments

圖2 基于主坐標（PCoA）（A）和非度量多維尺度（NMDS）（B）的群落結構分析Fig. 2 The principal coordinate analysis （PCoA） （A） and non-metric multi dimensional scale （NMDS） analysis （B） of soil microbial community structures relative to treatment

2.4 細菌功能

根據(jù)16S序列的分類注釋結果采用FAPROTAX工具對微生物群落功能注釋后共獲得63種功能分組，這些功能菌群包含1301個OTU，占全部OTU的16.3%，而其序列數(shù)占總序列數(shù)的27.7%。相對豐度較高的功能分組信息如圖3所示?？梢钥闯?，化能異養(yǎng)（包括chemoheterotrophy和aerobic chemoheterotrophy）、硝化作用（nitrification）、氨氧化作用（aerobic ammonia oxidation）、亞硝酸鹽氧化作用（aerobic nitrite oxidation）、硝酸鹽還原作用（nitrate reduction）功能類細菌相對豐度較高，分別占總細菌群落的14.9%、3.3%、2.0%、1.2%和1.1%。采用Tax4Fun功能預測工具對微生物群落功能注釋后共獲得41種二級（Level 2）功能分組和271種三級（Level 3）功能分組，其相對豐度排名前10的功能分組如圖4所示?？梢钥闯龆壓腿壏纸M中優(yōu)勢功能菌群的相對豐度在CK、FP、FGM各處理中均無顯著性差異。綠肥C/N比相對較低，還田后易被微生物快速分解，但分析數(shù)據(jù)表明參與碳氮代謝的微生物功能菌群（包括碳水化合物代謝、氨基酸代謝、氮代謝、氮循環(huán)等功能菌群）（圖3和圖4）在各處理之間并無差異，說明在本研究條件下綠肥施用并未改變土壤微生物功能。

圖3 不同處理條件下基于FAPROTAX預測的細菌功能分組豐度圖Fig. 3 Abundance of soil bacterial function groups predicted with the FAPROTAX tool relative to treatment

3 討 論

3.1 化學氮肥和綠肥施用對土壤生物化學性質的影響

本研究表明多年化學氮肥施用顯著提高了旱地土壤有機碳的含量，而對土壤微生物生物量氮、微生物生物量碳、可溶性有機氮、可溶性有機碳含量無顯著影響（表1），而王慧等［6］研究表明在黃土高原南部旱地，與對照相比，長期化學氮肥施用除了顯著增加旱地土壤有機碳含量外，還顯著提高了土壤有機氮、微生物生物量氮含量。此外，化學氮肥施用提高了玉米-小麥輪作體系土壤有機碳和有機氮含量［5］、潮土有機氮含量［8］、淮河中游水稻土［9］和黃淮海平原潮土［7］土壤微生物生物量碳氮含量。同時也有研究表明化學氮肥施用對旱地土壤有機碳、微生物生物量碳含量無顯著性影響［21］?？梢钥闯?，化學氮肥施用對不同生態(tài)區(qū)土壤生物化學性質影響不一，與不同區(qū)域土壤性質與氣候有關。

圖4 不同處理條件下基于Tax4Fun預測的細菌功能分組豐度圖（A.二級功能分組，B.三級功能分組）Fig. 4 Abundance of soil bacterial function groups predicted with the Tax4Fun tool relative to treatment（A.functional groups at level 2, B. functional groups at level 3）

與化學氮肥施用處理不同，氮肥+綠肥處理顯著提高了土壤有機碳、微生物生物量氮、微生物生物量碳、可溶性有機氮、可溶性有機碳（表1）。與處于該區(qū)域的綠肥研究結果一致［22-24］，他們研究也表明在化學氮肥施用基礎上種植綠肥翻壓后土壤有機碳、微生物生物量碳含量較只施用化學氮肥處理顯著提高。此外，冬閑期間綠肥作物種植（紫云英、油菜和黑麥草）顯著提高了湖南祁陽紅壤水稻土土壤有機質、全氮和堿解氮含量［25-26］；夏閑期間種植綠肥（籽粒莧）翻壓后同樣在一定程度上提高了河北廊坊日光溫室蔬菜大棚土壤可溶性有機碳、有機氮含量［27］。由此可知，種植綠肥處理可改善不同生態(tài)系統(tǒng)土壤性質，提高土壤肥力。

3.2 化學氮肥和綠肥施用對土壤細菌群落多樣性與功能的影響

化學氮肥施用對不同生態(tài)系統(tǒng)土壤細菌多樣性及群落組成有不同的影響［10,28-31］。本研究中，與對照相比，化學氮肥施用處理并未顯著改變旱地土壤的細菌多樣性（表2），與Koyama等［32］在美國北極苔原（Arctic tundra）和Shi等［30］在我國黑土土壤上的研究結果一致。同時亦有研究表明化學氮肥施用顯著提高［12］或降低了土壤細菌多樣性［10,28,33］。研究結果的差異可能與不同生態(tài)區(qū)土壤性質如有機碳、pH等因素有關。本研究中，土壤有機碳含量相對較低，盡管氮肥施用提高了土壤有機碳含量，但該土壤有機碳的絕對值相對較低（如對照處理僅有6.96 mg kg-1），有機質含量的提高不足以改變土壤細菌豐度及多樣性。而在我國東北的黑土上，土壤有機碳含量相對較高（15.8 mg kg-1），氮肥施用也提高了土壤有機碳含量，但其細菌多樣性反而下降，這與氮肥施用降低了土壤pH密切相關［33］。此外，化學氮肥施用處理還會影響到土壤中細菌群落組成。本研究中，化學氮肥施用處理未改變細菌門水平的群落組成（圖1 A），但改變了屬水平的群落組成（圖1B），與Zhong等［10］研究結果一致，說明在黃土高原旱地，氮肥包括綠肥的合理使用對土壤微生物的多樣性影響較小。

與化學氮肥施用不同，現(xiàn)有多數(shù)研究均表明綠肥施用處理可增加土壤中細菌的豐度和多樣性。如綠肥施用處理顯著增加了黃土高原旱區(qū)土壤中微生物總數(shù)、細菌和放線菌數(shù)量［34］，明顯提高了湖北山地黃棕壤中細菌及微生物總的磷脂脂肪酸（PLFAs）含量（即微生物總數(shù)）［35］，顯著增加了湖南紅壤性水稻土細菌群落豐度與多樣性［23］和湘西煙田土壤細菌群落多樣性，其中黑麥草綠肥還田處理提高幅度最大［36］。此外，綠肥施用也改變了細菌群落組成，如在湘西煙田中，綠肥施用增加了變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和綠彎菌門（Chloroflexi）相對豐度［36］；在湖南紅壤性水稻土上，綠肥施用改變了變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、厚壁菌門（Firmicutes）和浮霉菌門（Planctomycetes）的相對豐度［23］。而在本研究中，綠肥施用并未顯著影響到細菌的豐度、多樣性（表2）以及門水平的細菌群落相對豐度（圖1），僅改變了在屬水平的細菌群落相對豐度（圖1、表3）。研究結果的差異可能與不同生態(tài)區(qū)土壤性質和氣候等因素有關。

細菌在土壤養(yǎng)分循環(huán)中起著重要作用，其功能在一定程度上決定土壤肥力高低，但同時易受外界環(huán)境條件如施肥的影響。李曉慧［37］研究表明長期施氮肥導致了東北黑土土壤中氨氧化古菌豐度的下降和功能的退化，以及氨氧化細菌豐度的增加和功能的強化；卞碧云［38］研究表明長期高量施氮肥（N870、N696）明顯降低了太湖地區(qū)設施栽培蔬菜地土壤氨單加氧酶功能基因（amoA）的數(shù)量，導致土壤氨氧化作用顯著降低，主要是由土壤酸化引起的。此外，綠肥施用也可在一定程度改變土壤中細菌功能，袁秀梅［39］研究表明蠶豆綠肥覆蓋或翻壓均促進了土壤固氮功能細菌、氨化作用細菌、硝化作用細菌和反硝化作用等功能細菌數(shù)量的增長，即綠肥施用促進了土壤的固氮作用和氮素轉化過程。但在本研究中，與對照相比，化學氮肥和綠肥施用并未改變土壤中參與氮循環(huán)功能（如氮代謝、氨基酸代謝、氨氧化作用、硝化作用等）、碳代謝功能（如碳水化合物代謝、維生素代謝、淀粉和蔗糖代謝等）和其他功能細菌相對豐度（圖3和圖4），這與不同研究中的土壤性質和生態(tài)條件差異有關，亦可能與土壤細菌空間變異和高通量測序分析變異較大有關，導致處理之間變異較大，差異不顯著。

4 結 論

與對照相比，化學氮肥處理可顯著增加土壤有機碳含量，而氮肥+綠肥處理顯著提高了土壤有機碳、微生物生物量碳、微生物生物量氮、可溶性有機碳和有機氮含量?；瘜W氮肥和綠肥施用并未顯著影響細菌群落豐度、多樣性，未改變在門水平上的細菌群落組成以及主要功能基因細菌相對豐度，但改變了細菌在屬水平的群落組成。因此，化學氮肥和綠肥施用對該區(qū)域旱地土壤的細菌多樣性、群落組成和功能影響相對較小，但可在一定程度上提高土壤肥力。

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