韓明亮 關(guān)運祥

1)許昌縣人民醫(yī)院中醫(yī)科，河南 許昌 461000 2)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦病區(qū)，河南 鄭州 450000

腦部是人體中最為重要的之一，其對氧的敏感度不亞于其他任何組織器官。腦組織缺血是造成其他局部腦組織及功能障礙的重要前提，其損害程度與血流量和缺血時間有密切關(guān)系，短時間內(nèi)的不完全缺血是可逆性損傷，長期的完全缺血甚至?xí)斐赡X水腫、腦梗死[1-4]。腦缺血再灌注模型是一種造成腦功能嚴(yán)重?fù)p傷的模型，此時，腦細(xì)胞生物電出現(xiàn)病理性慢波，在缺血一段時間后發(fā)生再灌注，慢波加強并持續(xù)不斷，顳葉組織氨基酸代謝發(fā)生病理性變化，興奮性氨基酸，如谷氨酸、天冬氨酸等水平逐漸降低，抑制性氨基酸如丙氨酸、甘氨酸等水平顯著升高，隨著缺血時間的延長，腦組織細(xì)胞微結(jié)構(gòu)更加明顯，核染色質(zhì)聚集，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，鈣鹽沉積，血管內(nèi)血栓、髓鞘變性、分層，周圍間隙涌入水腫液，腦部呈不可逆?zhèn)?，這也是阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease，AD)等神經(jīng)性疾病發(fā)生的病理基礎(chǔ)[5-8]。本研究對健胃愈腦湯在改善腦缺血再灌注大鼠的認(rèn)知功能進(jìn)行相關(guān)研究。

1 資料與方法

1．1材料

1．1．1 動物：選取30只成年雄性SD大鼠(來源于江蘇省南京市亞東實驗動物研究中心)為研究對象，體質(zhì)量250～300(276.3±12.4)g。隨機分為健胃愈腦湯組、對照組和假手術(shù)組各10只，3組體質(zhì)量、性別等無顯著差異(P>0.05)，具有可比性。

1．1．2 藥品與試劑：健胃愈腦湯(由本院自行協(xié)定制作)，藥方：黨參6 g，白術(shù)10 g，半夏10 g，陳皮15 g，茯神10 g，神曲10 g，棗仁10 g，紅景天10 g，天麻10 g，甘草6 g。BDNF一抗(生產(chǎn)批號E-30664)、二抗(生產(chǎn)批號：970502)由sigma公司提供；RIPA裂解液(生產(chǎn)批號P0013)：50 mmol/L Tris-HCl (pH值7.4)，150 mmol/L NaCl，1% NP-40，0.1% SDS，由北京索萊寶科技有限公司提供。

1．1．3 儀器：Morris水迷宮系統(tǒng)(型號BW-MWM101，正華生物儀器有限公司)；凝膠成像儀(型號UVCI-01，香港馳冉有限公司)。

1．2治療方法

1．2．1 制備動物模型：大鼠術(shù)前禁食12 h，可自由飲水，再制作夾閉雙側(cè)頸總動脈合并低血壓全腦缺血再灌注模型。腹腔注射水合氯醛對大鼠進(jìn)行麻醉，注射量400 mg/kg，分離出雙側(cè)頸總動脈和右側(cè)頸總靜脈，靜脈插管并輸注200 mL肝素化生理鹽水，抽取30%大鼠血總?cè)萘康难?，夾閉左右頸總動脈，20 min后緩慢輸回血液，縫合傷口[9-11]。

1．2．2 給藥：假手術(shù)組大鼠僅分離出總動脈和總靜脈，對照組大鼠和健胃愈腦湯組建立腦缺血再灌注模型，健胃愈腦湯組大鼠術(shù)后1 d灌服生理鹽水稀釋的健胃愈腦湯，濃度10 g/L，1次/d，100 mg/(kg·次)，持續(xù)灌服2周。假手術(shù)組和對照組大鼠用等體積的生理鹽水灌胃。研究完成后處死大鼠[12-13]。

1．2．3 水迷宮實驗：術(shù)后第21～25天行Morris水迷宮(MWM)檢查，評估大鼠認(rèn)知功能的變化。MWM直徑200 cm，高50 cm，含直徑15 cm的圓臺，蓄水面高于圓臺1 cm。將大鼠于實驗前訓(xùn)練1 d，實驗時放大鼠于圓臺上提前適應(yīng)5 min，放水使其游泳至平臺，2 min內(nèi)未發(fā)現(xiàn)平臺的大鼠引至平臺再停留0.5 min并終止實驗。實驗2～3 d后放大鼠分別從不同象限入水訓(xùn)練，潛伏期超過2 min按2 min算，實驗5 d后撤出圓臺，隨機選擇某象限放大鼠入水，對實驗全過程進(jìn)行監(jiān)控，記錄大鼠潛伏期、平臺穿越次數(shù)和象限滯留時間[14-16]。

1．2．4 Western Blot檢測：術(shù)后第26天行Western blot檢查海馬區(qū)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)表達(dá)及基因表達(dá)。模型建造7 d后提取大鼠新鮮腦組織經(jīng)裂解分離全蛋白，采用BCA法測定目標(biāo)蛋白濃度，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉等過程后加入BDNF和一抗(1：1 500)，維持溫度5 ℃，過夜孵育，加入二抗，維持穩(wěn)度為37 ℃，2 h孵育，采用凝膠成像系統(tǒng)成像，分析BDNF和基因表達(dá)情況[17-19]。

1．2．5 Real time-PCR檢測：BDNF mRNA擴(kuò)增采用RT-PCR法，引物由上海迪奧生物公司合成。引物序列為：上游5'-TGAAAGAAGCAAACGTC-CACG-3'；下游5'-TGTTTGCGGCATCCAGGTA-3'。GADPH(內(nèi)參基因)：上游5'-CCCCACACACATGCACTTACC-3'；下游5'-CCTAGTCCCAGGGCTTTGATT-3'。擴(kuò)增之前先提取總的RNA，再通過RT-PCR反應(yīng)體系對基因進(jìn)行擴(kuò)增，觀察凝膠電泳成像結(jié)果[20-22]。

2 結(jié)果

2．1認(rèn)知能力迷宮實驗中，隨著大鼠訓(xùn)練時間的延長，潛伏期時間縮短，與假手術(shù)組相比，對照組潛伏期時間明顯增長(P<0.05)，大鼠空間學(xué)習(xí)能力受損嚴(yán)重；與對照組相比，健胃愈腦湯組潛伏期時間明顯縮短(P<0.05)，大鼠空間學(xué)習(xí)能力明顯恢復(fù)(表1)。此外，健胃愈腦湯組大鼠在目標(biāo)象限停留時間和圓臺穿越次數(shù)明顯多于對照組(P<0.05)，說明大鼠空間記憶能力得到顯著改善(表2)。

表1 3組大鼠潛伏期平均時間±s，s)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05

表2 3組目標(biāo)象限停滯時間及圓臺穿越次數(shù)比較±s)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05

2．2 3組BDNF mRNA表達(dá)情況對照組與假手術(shù)組BDNF mRNA比較明顯下降(P<0.05)，健胃愈腦湯組與對照組BDNF mRNA明顯升高(P<0.05，圖1)。

圖1 3組大鼠BDNF mRNA的表達(dá)

2．3 3組BDNF的蛋白表達(dá)情況對照組與假手術(shù)組BDNF 蛋白比較明顯下降(P<0.05)，健胃愈腦湯組與對照組BDNF蛋白明顯升高(P<0.05，圖1、表2)。

圖2 Western blot 蛋白的表達(dá)

圖3 3組大鼠BDNF蛋白的表達(dá)

3 討論

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotro-phic factor，BDNF)廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在神經(jīng)元的生長分化過程中起到十分重要的作用，可防止神經(jīng)元受損，改善其病理狀態(tài)，是維持中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元正常生理功能的必要性因素[23-26]。研究表明，BDNF在調(diào)節(jié)患者痛苦和恐懼中也有重要功能，可穩(wěn)定創(chuàng)傷后壓力紊亂，覆蓋痛苦記憶，重建信心和安全感，現(xiàn)已作為“忘憂藥”使用并取得成功[27-31]。健胃愈腦湯通過上調(diào)體內(nèi)BDNF水平，達(dá)到緩解焦慮，促進(jìn)神經(jīng)元自我恢復(fù)的作用，其作用機制可能與藥方中紅景天、黨參、神曲等神經(jīng)保護(hù)功能有關(guān)，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的再生和分化，促進(jìn)腦功能的恢復(fù)[32-38]。

中醫(yī)認(rèn)為，人至老年，由于勞倦過度，飲食不節(jié)，會導(dǎo)致久病體虛，脾胃虧虛，運化失司，水液代謝障礙，水津停滯，易致痰阻腦絡(luò)，或氣虛不能運血，血液瘀滯腦絡(luò)；氣、血、痰、瘀諸邪內(nèi)阻，上擾清竅，造成老年人精血虧損，腦髓空虛，元氣不足，陰陽失調(diào)。簡而言之，老年人易胃氣虧虛為本，痰瘀犯腦為標(biāo)，痰瘀阻滯、腦神失聰導(dǎo)致AD的發(fā)生[39-42]。結(jié)合中醫(yī)辨證理論及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究理論而制定的治療氣血虧虛型阿爾茨海默病的有效方劑健胃愈腦湯可明顯改善這一癥狀，Morris水迷宮實驗證明大鼠的學(xué)習(xí)能力、空間記憶能力和認(rèn)知能力得到明顯的改善[43-46]。與假手術(shù)組相比，對照組潛伏期時間明顯增長(P<0.05)，因?qū)φ战M經(jīng)腦缺血再灌注模型建立后，腦部血流量減少，供氧能力減弱，腦部機能遭破壞，尤其是大鼠空間學(xué)習(xí)能力受損嚴(yán)重；與對照組相比，健胃愈腦湯組大鼠腦部功能恢復(fù)較好，學(xué)習(xí)能力增強，潛伏期時間明顯縮短(P<0.05)，大鼠空間學(xué)習(xí)能力明顯恢復(fù)[47-50]。此外，健胃愈腦湯組大鼠在目標(biāo)象限停留時間和圓臺穿越次數(shù)明顯多于對照組(P<0.05)，說明通過健胃愈腦湯治療后的大鼠對圓臺的空間位置記憶十分清楚，因而穿越次數(shù)明顯增多，反映其空間記憶能力得到顯著改善。對照組相對于假手術(shù)組BNDF mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，說明手術(shù)模型成功。BNDF mRNA和蛋白表達(dá)明顯高于對照組(P<0.05)，說明增加了BNDF的表達(dá)[51-55]。本研究表明，健胃愈腦湯通過提高BNDF的表達(dá)而改善腦缺血再灌注大鼠的認(rèn)知功能，促進(jìn)腦損傷的恢復(fù)，但其藥理、藥效機制仍需進(jìn)一步探討。

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