劉 偉 楊 鵬 李于紅 洪 琛 羅華立 顧衛(wèi)軍

惡性腫瘤的形成與發(fā)展是一個復雜的病理過程，涉及到多個腫瘤基因，多種致癌通路。整合素鏈接激酶（integrin-linked kinase，ILK）屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶[1]。其在腫瘤形成的相關(guān)因素中處于交叉部位，并與惡性腫瘤的發(fā)展、侵犯和遷移有著密切的關(guān)系。上皮細胞鈣黏素（E-cadherin）是一種黏附分子，具有鈣依賴性，大多存在于上皮細胞中，主要在同型細胞之間起黏附反應，并在細胞骨架中起重要作用[2]，在維持細胞形態(tài)和調(diào)節(jié)細胞黏附中具有重要作用。研究[3-5]表明，ILK與E-cadherin在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。我們采用免疫組織化學方法對結(jié)腸癌組織ILK和E-cadherin表達進行檢測，探討ILK及E-cadherin表達水平與結(jié)腸癌的臨床病理特征的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年—2016年期間于我院施行結(jié)腸癌根治性手術(shù)的50例標本，均未施行放療和化療，25例正常結(jié)腸組織標本中有15例選取距離惡性腫瘤邊緣至少5cm以上，并經(jīng)病理證明為正常結(jié)腸組織，10例正常結(jié)腸組織來自良性疾病結(jié)腸部分切除標本。兩組數(shù)據(jù)符合分類變量的統(tǒng)計學處理原則。實驗標本采用甲醛溶液固定，所有標本石蠟包埋，標本切片厚度為4μm。50例結(jié)腸癌患者中男27例，女23例，年齡44～82歲，中位年齡57歲。腫瘤分化程度：高中分化13例，低分化37例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者22例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者28例；按美國腫瘤聯(lián)合會（AJCC）制定的 Dukes分期法[6]：A+B 期 24例，C+D期26例。

1.2 主要試劑 兔抗人ILK多克隆抗體（批號16B10235）；鼠抗人E-Cadherin單克隆抗體（批號16A10609）購自北京信生元生物醫(yī)學科技有限公司。SP免疫組化檢測試劑盒購自上海研卉生物科技有限公司；DAB顯色試劑盒自北京諾博萊德科技有限公司購得。

1.3 免疫組織化學染色方法 確定標本的組織學類型及分化程度行常規(guī)HE染色。50例結(jié)腸癌及25例結(jié)腸正常組織均行抗整合素連接激酶（ILK），抗E-cadherin的免疫組織化學染色，每一個蠟塊標本連續(xù)切片4～5張，厚約4μL。切片脫蠟，水化后嚴格按照S-P法試劑盒說明書步驟進行?？乖迯陀脵幟仕峋彌_液。一抗工作時濃度為1：50。運用DAB顯色試劑盒染色，對比染色采用蘇木素，封片采用中性樹膠。陰性對照采用PBS代替一抗。染色為SP法過氧化物酶標記的堿性磷酸酶染色。

1.4 結(jié)果判定 每張病理切片選擇約3個高倍視野，在每個視野中由約3個病理科醫(yī)師計數(shù)100個腫瘤細胞。整合素連接激酶（ILK）蛋白在腫瘤細胞漿中染色呈現(xiàn)為黃色或者為棕黃色提示為陽性，根據(jù)陽性染色細胞的百分率進行統(tǒng)計:如果百分率≤5%記分為0分，在6%～50%之間記為1分，50%～80%記為2分，＞80%記為3分。陰性評分為0～1分，陽性評分在2～3分之間。E-cadherin蛋白在腫瘤細胞質(zhì)中染色為棕黃色為表達陽性，無染色提示陰性。采用Gofuku等[7]的判定標準，陽性細胞數(shù)＞70%判定為正常表達，＜70%提示表達異常，判定為陽性。

1.5 統(tǒng)計學方法 應SPSS19.0軟件，計數(shù)資料比較，采用χ2檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌組織及結(jié)腸正常組織ILK和E-cadherin表達情況 ILK在細胞質(zhì)中出現(xiàn)不同程度染色為黃色顆粒時提示為陽性（封三圖1）。結(jié)腸癌組ILK表達陽性率 66.0%（33/50），正常結(jié)腸組表達陽性率24.0%（6/25）。結(jié)腸癌組織ILK表達陽性率明顯高于正常結(jié)腸組（P＜0.05）。E-cadherin在結(jié)腸癌細胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色染色為低表達（封三圖2）。結(jié)腸癌組E-cadherin表達陽性率42.0%（21/50），正常結(jié)腸組表達陽性率96.0%（24/25），結(jié)腸癌組織E-cadnerin表達陽性率明顯低于正常結(jié)腸組（P＜0.05），見表1。

表1 結(jié)腸癌組及正常結(jié)腸組ILK和E-cadherin表達[例（%）]

2.2 ILK和E-cadherin表達與結(jié)腸癌各臨床病理因素之間的關(guān)系 統(tǒng)計分析顯示，ILK表達與結(jié)腸癌臨床分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P均＜0.05），與性別、腫瘤大小無關(guān)（P＞0.05）；雖然ILK在低分化結(jié)腸癌組織表達上調(diào)，但高、中、低分化之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。E-cadherin表達與結(jié)腸癌的臨床分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及結(jié)腸癌的分化程度均有關(guān)（P均＜0.05），但與腫瘤大小、性別無關(guān)（P＞0.05），見表 2。

表2 ILK和E-cadherin表達與各個臨床病理因素相關(guān)性[例（%）]

2.3 ILK和E-cadherin相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)分析顯示，ILK與E-cadherin在結(jié)腸癌組織表達呈負相關(guān)（r=-0.421，P＜0.05），見表 3。

3 討論

整合素連接激酶（ILK）是一種含有多個錨蛋白重復序列的絲/蘇氨酸蛋白激酶，分子大小為59KD，它的基因定位于染色體11p5.5-11p15.4。ILK可以介導細胞與細胞外基質(zhì)（ECM）之間的跨膜信號轉(zhuǎn)導過程；可以參與調(diào)節(jié)控制整合蛋白、并可以參與Wnt等多條信號轉(zhuǎn)導通路。通過以上各種轉(zhuǎn)導方式進而影響細胞的增生、凋亡、細胞黏附和遷移[8]。

表3 ILK和E-cadherin表達相關(guān)性

ILK過量表達能夠促進一部分依賴性的腫瘤細胞存活。整合素是一種重要的黏附分子，ILK能提高細胞的可運動性，主要是它存在于整合素和肌動蛋白細胞骨架之間這一有利的中間位置，從而促進腫瘤的轉(zhuǎn)移。在活體外，ILK能磷酸化PKB/Akt，激活PKB傳導通路，抑制上皮細胞的凋亡。ILK激活是通過黏附到細胞外基質(zhì)和磷脂酰肌醇（-3）激酶（PI3K）依賴途徑的生長因子來實現(xiàn)的，ILK激活促進了細胞的存活并保護抑制了細胞的凋亡。在上皮細胞中ILK的過表達導致了停泊非依賴性細胞的增長，細胞周期的延長，并且增強細胞周期蛋白A的表達，增強了細胞的致瘤性[9]，ILK表達可抑制GSK3的活性，并能增強了轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1（activatorprotein-1，AP-1）的活性，從而導致細胞轉(zhuǎn)移能力的增強，當ILK的高表達時，能夠?qū)е禄|(zhì)金屬蛋白酶-9（matrixmetalloproteinase-9，MMP-9） 上調(diào)，MMP-9 可以通過AP-1轉(zhuǎn)錄因子途徑。MMP-9表達增加，從而參與生長因子信號通路，這些通路的激活在一定程度上可以降解細胞外基質(zhì)、促進惡性腫瘤組織中血管的形成；增強了細胞運動，從而促進了惡性腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[10]。ILK還能夠磷酸化PKB Akt的Ser473，阻礙上皮細胞的凋亡，ILK是可以作用于一些磷酸化的調(diào)控元件，這些調(diào)控元件位于PKB Akt上游區(qū)，這些元件參與一些癌基因與PI3K通路，促進VEGF的表達，VEGF促進血管內(nèi)皮細胞增殖、從而導致腫瘤血管的生成[11]。研究表明ILK在卵巢癌[12]、非小細胞肺癌[13]、胃癌[14]、乳腺癌[15]、喉鱗狀細胞癌[16]的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用，ILK具有癌基因的特性。本研究結(jié)果顯示，在50例結(jié)腸癌組織ILK的陽性表達率（66.0%）高于正常結(jié)腸組（P＜0.05），ILK 蛋白表達水平與臨床分期、結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P＜0.05），與結(jié)腸癌的分化程度無關(guān)（P＞0.05）。結(jié)果提示，在結(jié)腸癌組織ILK的高表達會刺激結(jié)腸癌中某些惡性腫瘤相關(guān)因子活化以及某些與惡性腫瘤擴散相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導通路，進而促進結(jié)腸癌的發(fā)生，并促進結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移及侵襲，提示ILK高表達在結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移中起到了一定作用。

E-cadherin基因定位于16q22.1，是一種廣泛分布于上皮細胞的鈣依賴性細胞黏附分子。E-cadherin作為最重要的黏附分子，其表達異常將導致細胞的聚集、甚至侵襲和轉(zhuǎn)移，從而形成惡性腫瘤。研究[17]表明，在某些惡性腫瘤的組織E-cadherin的丟失導致細胞間接觸的減弱，進而導致組織的惡性變及惡性腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，E-cadherin在正常結(jié)腸組織中高表達，而在結(jié)腸癌組織中表達率明顯降低（P＜0.05）；E-cadherin表達水平與結(jié)腸癌臨床分期分化程度，結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05），表明隨著結(jié)腸癌的惡性程度進展加劇，E-cadherin表達也會有所下降，E-cadherin低表達導致細胞之間黏附減弱，從而引起結(jié)腸癌細胞發(fā)生擴散、轉(zhuǎn)移，提示E-cadherin表達異常與結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，E-cadherin低表達提示患者預后不良。

研究[18]表明，ILK能夠激活E-caherin的抑制物S-nail，從而使E-cadherin表達下調(diào)、細胞間連接減弱或消失，從而導致惡性腫瘤侵襲性的增加。本實驗結(jié)果顯示，在結(jié)腸癌組織ILK表達與E-cadherin表達呈負相關(guān)（P＜0.05），這與既往文獻報道結(jié)果一致[19]?？赡艿脑驗镮LK過表達誘導轉(zhuǎn)錄因子Snail及ZEB1表達，這個過程是通過磷酸化激活PKB來實現(xiàn)的，從而抑制E-caherin表達，兩者的共同反應促進結(jié)腸癌的侵犯和遷移、擴散。

總之，ILK及E-cadherin在結(jié)腸癌的發(fā)生、侵犯、轉(zhuǎn)移中起到積極的作用，兩者在結(jié)腸癌進展中相互作用。臨床上聯(lián)合檢測ILK及E-cadherin有助于評估結(jié)腸癌的生物學行為，可能是結(jié)腸癌的一個新的診斷和治療的標志。

圖1 ILK在結(jié)腸癌組織高表達（HE×200）

圖2 E-cadherin在結(jié)腸癌組織低表達（HE×200）

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