蔣珍鳳 羅冬嬌 童夏生 范廣民 王恩智

冬蟲夏草富含多糖、氨基酸、脂肪酸、甘露醇及多種微量元素等，具有調(diào)節(jié)機體免疫、改善糖尿病腎病的病情、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡等多種作用[1-2]。核苷酸結(jié)合寡聚域（nucleotide-binding oligomerization domain，NOD）樣受體是模式識別受體的一種，參與細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，在天然免疫系統(tǒng)中起著非常重要的作用，參與機體的抗感染、炎癥性腸病、腫瘤等多種疾病的發(fā)病機制[3-4]。本研究觀察冬蟲夏草對哮喘模型大鼠肺組織NOD1和NOD2表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材 料 兔抗鼠多克隆NOD2抗體購自biorbyt公司（批號P10336）；Ⅴ級卵白蛋白（OVA）（批號：A5503）購自美國Sigma公司。冬蟲夏草150g，購于西藏自治區(qū)拉薩正清商貿(mào)有限公司，文火煎沸3h，濾出煎液，同前復(fù)煎1次，兩次液體混勻后（約600mL），4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗動物及分組 24只清潔級健康雄性SD大鼠[許可證號：SCXK（浙）20140001]，4～5 周齡，平均體質(zhì)量128g，飼養(yǎng)于杭州師范大學(xué)實驗動物中心，自由進食和飲水。按照數(shù)字表隨機分為哮喘組、對照組、冬蟲夏草組，每組8只。

1.3 大鼠哮喘模型制備及給藥 參照文獻[5]，采用OVA致敏的方法復(fù)制哮喘模型。冬蟲夏草組在OVA霧化激發(fā)前一天開始至霧化結(jié)束，每天1次給予冬蟲夏草5mL/只灌胃[6]，共15天。

1.4 留取肺組織 OVA霧化結(jié)束后次日，水合氯醛腹腔注射麻醉，心臟抽血至死。取左肺外緣組織，剪成0.5cm×0.5cm大小塊狀，液氮保存，實時熒光定量PCR法（qPCR）檢測肺組織NOD1和NOD2 mRNA表達量。另取左肺門組織，多聚甲醛固定、切片，HE染色觀察肺組織炎癥變化，免疫組化法檢測NOD2表達量。

1.5 免疫組化SP法檢測 陽性細胞胞漿呈棕黃色表達，每張切片隨機選擇5個視野，Image-pro Plus 5.1免疫組化圖像分析系統(tǒng)對陽性細胞進行灰度掃描，取其平均值代表該片的光密度（optical density，OD）值[5]。

1.6 qPCR檢測方法檢測肺組織NOD1和NOD2 mRNA表達[5]研磨肺組織，Trizol-離心柱法提取總RNA，轉(zhuǎn)錄成cDNA。NOD1的上游引物為5’-AGCT AACCTCCTAAGCGGGA-3’，下游引物為 5’-TCGGT GACCAGCAGAAAGAC-3’，產(chǎn)物大小為 348bp；NOD2的上游引物為5’-FCCTTTGAACTGCAAGGGTGC-3’，下游引物為 5’-RGGCAAAGATTCTCCGACCCA-3’，產(chǎn)物大小為396bp；內(nèi)參β-Actin的上游引物為5’-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3’，下游引物為 5’-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3’， 產(chǎn)物大小為150bp。結(jié)果分析采用比較 CT值法：△△CT=（CTNOD-CTβ-actin） 實驗組-（CTNOD-CTβ-actin）對照組，基因相對表達量（RQ值）采用2-△△CT方法計算。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩變量相關(guān)分析采用直線相關(guān)分析法，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s） 表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組哮喘模型大鼠肺組織NOD2蛋白表達比較

陽性細胞主要為氣道上皮細胞、淋巴細胞等，其胞漿呈棕黃色表達。哮喘組大鼠肺組織NOD2蛋白的光密度值顯著低于對照組（P＜0.01），冬蟲夏草組顯著高于哮喘組（P＜0.05）。見表 1、封四圖 1。

表1 各組哮喘模型大鼠肺組織NOD2表達量比較（±s）

表1 各組哮喘模型大鼠肺組織NOD2表達量比較（±s）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與哮喘組比較，△P＜0.05；NOD：核苷酸結(jié)合寡聚域

組別對照組哮喘組冬蟲夏草組鼠數(shù)888 NOD2（OD 值）0.24±0.03 0.18±0.03**0.23±0.02△

2.2 各組哮喘模型大鼠肺組織NOD1和NOD2 mRNA表達比較 抽提物總RNA的A260/A280比值在1.8～2.0之間，目的基因NOD1、NOD2和內(nèi)參基因β-actin的熔解曲線均為單一峰，基因擴增曲線呈標準S型。哮喘組大鼠肺組織NOD1 mRNA表達量顯著低于對照組（P＜0.01）；冬蟲夏草組大鼠肺組織NOD1 mRNA表達量顯著高于哮喘組（P＜0.01）。哮喘組大鼠肺組織NOD2 mRNA表達量與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；冬蟲夏草組大鼠肺組織NOD2 mRNA表達量顯著高于哮喘組（P＜0.05）。見表2。

表2 各組哮喘模型大鼠肺組織NOD1和NOD2 mRNA表達量比較（±s）

表2 各組哮喘模型大鼠肺組織NOD1和NOD2 mRNA表達量比較（±s）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與哮喘組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；NOD：核苷酸結(jié)合寡聚域

鼠數(shù)組別對照組哮喘組冬蟲夏草組888 NOD1 RQ 值（2-△△CT）1 0.62±0.34**0.98±0.22△△NOD2 RQ 值（2-△△CT）1 0.92±0.32 1.27±0.48△

2.3 各組哮喘模型大鼠肺組織炎癥 HE染色顯示，對照組肺組織結(jié)構(gòu)完整、細胞清晰，炎癥細胞和支氣管腔內(nèi)分泌物少見；哮喘組見上皮細胞和黏液腺增生，見較多炎性細胞，有些管腔見黏液栓等；冬蟲夏草組炎性改變較哮喘組減輕（見封四圖2）。

2.4 相關(guān)性分析 哮喘模型大鼠肺組織NOD2 mRNA與蛋白表達水平無顯著相關(guān)性（n=24，r=0.32，P＞0.05）；NOD1 mRNA 與 NOD2 mRNA 表達水平無顯著相關(guān)性（n=24，r=0.20，P＞0.05）。

3 討論

模式識別受體包括膜結(jié)合受體和細胞內(nèi)模式識別受體等，前者包括Toll樣受體，后者包括NOD樣受體。迄今為止，共發(fā)現(xiàn)22個NOD樣受體家族成員，其中最具代表性的是NOD1和NOD2。NOD樣受體分布于細胞胞漿中，可以識別進入細胞內(nèi)的病原體及其產(chǎn)物，在天然免疫中發(fā)揮重要作用。研究[7]發(fā)現(xiàn)，NOD樣受體與多種肺部炎癥性疾病有關(guān)，例哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺損傷等，但其機制尚未清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)，NOD2表達于肺組織的氣道上皮細胞、淋巴細胞等，且哮喘組大鼠肺組織NOD2蛋白的表達水平低于對照組（P＜0.01），提示NOD2可能與哮喘的氣道炎癥密切相關(guān)。同時發(fā)現(xiàn)哮喘組大鼠NOD2 mRNA的表達量與對照組無差異（P＞0.05）。相關(guān)分析表明，大鼠肺組織NOD2 mRNA和蛋白的表達水平無顯著相關(guān)性（P＞0.05）。相似的結(jié)果也見于其他學(xué)者的報道，在哮喘大鼠肺組織NOD2蛋白表達下降，認為NOD2表達減弱可能與哮喘氣道炎癥有關(guān)[8]。通過流式細胞術(shù)也發(fā)現(xiàn)，在哮喘患者趨化因子CCR3陽性的粒細胞中，NOD2表達下降[9]。而在急性發(fā)作期哮喘患者外周單個核細胞中，NOD2 mRNA表達量高于慢性持續(xù)期哮喘患者且高于健康對照組，認為NOD2 mRNA表達增加促進哮喘炎癥并與哮喘嚴重程度相關(guān)[10]。以上研究發(fā)現(xiàn)，哮喘NOD2 mRNA表達不一致的原因可能與其表達的組織或細胞不同有關(guān)。本研究同時還發(fā)現(xiàn)，哮喘組大鼠肺組織NOD1 mRNA 表達水平低于對照組（P＜0.01），提示NOD1 mRNA表達不足可能與哮喘氣道炎癥有關(guān)。通過相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，NOD1和NOD2 mRNA無顯著相關(guān)性（P＞0.05），提示NOD家族mRNA水平的改變不具有一致性。

目前認為，NOD1和NOD2的失調(diào)與多種炎癥性疾病相關(guān)，選擇性地抑制以它們及其下游區(qū)的信號蛋白為靶點可能是治療疾病的有效方法[11]。冬蟲夏草是一種屬于中藥的免疫調(diào)節(jié)劑，蟲草素是冬蟲夏草上的主要活性成分，具有降血脂、抗腫瘤、減輕哮喘癥狀的功效[12]，但其治療機制尚未完全清楚。本研究結(jié)果顯示，冬蟲夏草組大鼠肺組織炎癥細胞、炎癥反應(yīng)較哮喘組減輕，且冬蟲夏草組大鼠NOD2蛋白及mRNA和NOD1 mRNA表達水平高于哮喘組，提示冬蟲夏草可能具有上調(diào)NOD1和NOD2表達的作用，通過上調(diào)模式識別受體的表達起到減輕哮喘氣道炎癥的作用。相似的研究[13]也發(fā)現(xiàn)，蟲草多糖能減少哮喘患者氣道中炎癥細胞的浸潤、減輕氣道上皮損傷和水腫、降低氣道高反應(yīng)、下調(diào)炎癥因子的釋放。在慢性阻塞性肺疾病中，冬蟲夏草具有減輕癥狀、改善肺功能、提高生存質(zhì)量、增強心功能等作用，其治療機制可能通過增強免疫功能、抑制炎癥反應(yīng)和減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)等[14]。

綜上所述，哮喘模型大鼠肺組織NOD1和NOD2的表達下降，冬蟲夏草能上調(diào)哮喘模型大鼠肺組織NOD1和NOD2的表達，冬蟲夏草可能通過上調(diào)模式識別受體的水平起到治療哮喘的作用。

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