王淑妍 張士嶺 李 璐 王素英 張慧芝 黃春鑫

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC，以下簡稱肝癌），在我國的發(fā)病率為25.7/10萬，居全球之首，5年以上生存率僅為10%左右[1]。準(zhǔn)確診斷HCC是臨床制定治療方案的前提，但在實際病理工作中卻面臨許多困難，早期HCC腫瘤異型性小，結(jié)構(gòu)異常也不明顯，容易與肝硬化及腺瘤等良性疾病混淆；分化較差時，又與膽管細(xì)胞癌形態(tài)有很大重疊，僅憑形態(tài)準(zhǔn)確區(qū)分兩者有時十分困難。因此，尋找特異性強(qiáng)的手段準(zhǔn)確識別HCC是十分必要的。Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）途徑作為一條控制胚胎發(fā)育且參與多種人類腫瘤發(fā)生的重要信號途徑，其異常激活與肝癌關(guān)系密切，β-catenin是該信號傳導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵調(diào)控因子，在細(xì)胞增殖及分化上起重要作用，磷脂酰肌醇蛋白聚糖 3（glypican-3，GPC3）參與 Wnt通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，且與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[2]。本研究利用免疫組化方法對β-catenin、谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）及GPC3在 HCC組織的表達(dá)進(jìn)行觀察與分析，探討這三項指標(biāo)在HCC的診斷、鑒別診斷價值及在HCC發(fā)生、發(fā)展中的作用價值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集浙江省寧波市臨床病理診斷中心組織病理科2016年1月—2017年8月行手術(shù)治療的HCC組織標(biāo)本87例，病理診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)WHO（2010）消化系統(tǒng)腫瘤分類和原發(fā)性肝癌規(guī)范化病理診斷指南（2015）[3]，均為原發(fā)性肝癌患者。其中男68例，女 19例，男：女為 3.58:1，年齡 31～78歲，中位年齡60歲，平均年齡58.63歲。87例肝細(xì)胞肝癌中腫塊大?。?.0cm者28例，腫塊≥3.0且≤5.0cm者29例，＞5.0cm者30例；高分化15例，中分化53例，低分化 19例；肝癌（tumor node metastasis，TNM）分期[3]Ⅰ期59例，Ⅱ期23例，Ⅲ期4例，Ⅳ期1例。取癌旁1cm及1cm以外肝組織，行微血管侵犯（microvascular invasion，MVI）風(fēng)險分級[3]，其中 M0：63 例，M1：16例，M2：8例。取相應(yīng)的癌旁組織70例及肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌 （intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）40 例作為對照。癌旁組織組70例中男53例，女17例，男：女為3.12:1，年齡35～78歲，中位年齡61歲，平均年齡56.50歲；ICC組40例中男31例，女9例，男：女為3.44:1，年齡33～72歲，中位年齡58歲，平均年齡52.50歲。各組間性別、年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方 法 所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片厚3～5μm，常規(guī)HE染色及免疫組化染色。免疫組化采用EnVision二步法，用Ventana Benchmark XT全自動免疫組化儀（Roche Ventana公司）染色，操作按說明書進(jìn)行。一抗 β-catenin（DAK-calret）、GPC3（IG12）及 GS（GS-6）均購自羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司。以TBS替代一抗作陰性對照。

1.3 結(jié)果判定 由兩位病理醫(yī)師采用雙盲法對免疫組化結(jié)果進(jìn)行半定量評估。β-catenin主要表達(dá)于細(xì)胞膜，染色結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)[4]：正常表達(dá)為細(xì)胞膜陽性表達(dá)＞70%；表達(dá)缺失為細(xì)胞膜陽性表達(dá)＜70%；異位表達(dá)為胞質(zhì)或胞核陽性表達(dá)，即細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核陽性表達(dá)＞10%。胞膜表達(dá)缺失、異位表達(dá)統(tǒng)稱為異常表達(dá)。GS在正常肝組織內(nèi)及癌旁表達(dá)于終末肝靜脈周圍的肝細(xì)胞，異常表達(dá)判斷標(biāo)準(zhǔn)為：GS主要定位于細(xì)胞漿，在腫瘤細(xì)胞中呈彌漫性表達(dá)，且＞10%的腫瘤細(xì)胞呈陽性，至少為中度染色；GPC3主要定位于細(xì)胞漿及細(xì)胞膜，其陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)：至少5% 的細(xì)胞呈陽性，不論染色程度；GPC3陰性：低于5%的細(xì)胞呈陽性，不論染色程度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，三種抗體在不同實驗組中的陽性率比較采用χ2檢驗，并采用Spearman相關(guān)性檢驗在HCC組織表達(dá)的相關(guān)性，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組β-catenin、GS及GPC3表達(dá)量比較 βcatenin蛋白正常弱表達(dá)于癌旁肝細(xì)胞的細(xì)胞膜，在原發(fā)性肝癌中呈不同程度的異位表達(dá)（封三圖1），主要為胞漿異位表達(dá)且染色強(qiáng)度中度及以上。βcatenin在HCC、ICC及癌旁組織的異常表達(dá)率分別為72.41%、70.0%及15.71%，肝癌組織中的異常表達(dá)率顯著高于癌旁組織（P＜0.05）；HCC與ICC之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.079，P＞0.05）；HCC、ICC 與癌旁組織之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=50.046，χ2=27.513，P均＜0.05）。由于GS在正常肝組織內(nèi)及癌旁表達(dá)于終末肝靜脈周圍的肝細(xì)胞（封三圖2），在癌組織中GS陽性率及陽性范圍明顯增強(qiáng)（封三圖3）。因此，對GS免疫組化結(jié)果的判讀既要觀察染色面積，也要兼顧染色強(qiáng)度，同時還要排除組織中血管因素的影響。GS在HCC、ICC及癌旁組織的異常表達(dá)率分別為87.36%、40.0%及5.71%，在HCC與ICC表達(dá)率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=30.781，P＜0.05），HCC、ICC與癌旁組織之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=103.458，χ2=20.114，P＜0.05）。GPC3（封三圖 4）在 HCC、ICC 及癌旁組織的異常表達(dá)率分別為73.56%、2.50%及2.86%，GPC3在HCC與ICC表達(dá)率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=55.382，P＜0.05），HCC 與癌旁組織表達(dá)率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=79.588，P＜0.05），ICC 與癌旁組織之間表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.012，P＞0.05），見表1。

2.2 β-catenin、GS及GPC3表達(dá)和HCC臨床病理特征的關(guān)系 HCC組織β-catenin及GS異常率在不同年齡、腫瘤直徑、分化程度、臨床分期（TNM）及MVI風(fēng)險分級差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；GPC3陽性率在不同性別、年齡、腫瘤直徑、臨床分期（TNM）及MVI風(fēng)險分級差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而在不同病理分化程度有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表2。

表1 各組β-catenin、GS及GPC3表達(dá)情況（例）

表2 β-catenin、GS及GPC3表達(dá)和HCC臨床病理特征的關(guān)系（例）

2.3 β-catenin、GS及GPC3在HCC組織表達(dá)的相關(guān)性 經(jīng)Spearman相關(guān)性檢驗表明，HCC組織βcatenin及GPC3蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（rs=0.229，P＜0.05）。β-catenin與 GS蛋白表達(dá)無相關(guān)性（rs=0.164，P=0.129），GS與GPC3蛋白表達(dá)無相關(guān)性（rs=0.153，P=0.160）。

3 討論

β-catenin是1980年由德國科學(xué)家首先發(fā)現(xiàn)的一個定位于胞質(zhì)的可溶性蛋白，人類β-catenin又叫CTNNB1基因，是果蠅Armadillo基因產(chǎn)物在哺乳類動物的同源類似物[5]。CTNNB1基因編碼的β-catenin蛋白是一種多功能蛋白，一方面參與細(xì)胞間的黏附，另一方面是經(jīng)典Wnt信號通路中重要的轉(zhuǎn)錄激活因子，是Wnt/β-catenin蛋白通路的決定性組成部分[6]。

正常的肝組織β-catenin表達(dá)于細(xì)胞膜，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)弱表達(dá)，核內(nèi)無表達(dá)，而HCC組織存在多種機(jī)制導(dǎo)致β-catenin核內(nèi)的異常積聚，造成β-catenin在胞質(zhì)積聚和/或核轉(zhuǎn)位[7-9]。Zulehner等[10]研究了133例HCC患者，發(fā)現(xiàn)58.6%具有β-catenin在細(xì)胞質(zhì)和核內(nèi)積聚現(xiàn)象，而且這些患者的腫瘤中有血管侵襲與轉(zhuǎn)移，生存時間明顯縮短，表明β-catenin的核內(nèi)聚集與與肝細(xì)胞的去分化及增加惡性程度密切相關(guān)。本實驗發(fā)現(xiàn)，β-catenin在主要在胞質(zhì)的異常積聚，但未發(fā)現(xiàn)在核上表達(dá)及細(xì)胞膜失表達(dá)，推測可能與實驗室抗體差異有關(guān)；β-catenin在HCC、ICC及癌旁組織的異常表達(dá)率分別為72.41%、70.0%及15.71%，且與年齡、腫瘤直徑、分化程度、臨床分期（TNM）及 MVI風(fēng)險分級差異等均無關(guān)（P＞0.05），但在癌組織與癌旁正常組織表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），這表明β-catenin蛋白異常表達(dá)可能在原發(fā)性肝癌的發(fā)生中發(fā)揮重要作用，對于HCC的診斷具有一定意義，但在HCC、ICC組織二者無明顯差異（P＞0.05），因此不能對鑒別提供幫助。

GS是催化谷氨酸與氨合成谷氨酰胺的酶家族成員之一，在肝臟氨解毒、氮平衡及pH值調(diào)節(jié)功能中起重要作用。但已有研究[11]表明：人肝癌組織中的GSmRNA、GS蛋白活性較非肝癌組織顯著升高，HCC癌組織中GS的過表達(dá)可成為HCC早期診斷與預(yù)后判斷的生物標(biāo)記。Chayanupatkul等[12]研究認(rèn)為，HCC患者的血清GS分泌水平及肝組織GS蛋白表達(dá)水平均較非肝癌患者明顯升高，與甲胎蛋白（AFP）水平呈正相關(guān)，認(rèn)為其可能成為HCC診斷的新標(biāo)記物。GS正常表達(dá)于癌旁及正常肝組織終末肝靜脈周圍的肝細(xì)胞，本實驗中GS在HCC中彌漫/片狀陽性表達(dá)，與癌旁正常組織表達(dá)模式具有顯著不同，在HCC、ICC及癌旁組織的異常表達(dá)率分別為87.36%、40.0%及5.71%，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），對于HCC診斷以及HCC與ICC鑒別診斷有重要價值。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖 3（Glypican3，GPC-3）屬于glypican家族，其基因定位于人染色體Xq261，是一種對分子量為66Kda的分泌性細(xì)胞外糖蛋白，可以依靠磷脂酰肌醇錨定在細(xì)胞膜上[13]；通過結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)、GF和蛋白酶等影響信號傳遞，在調(diào)控細(xì)胞生長和分化方面起重要作用。GPC-3的基因在胎兒高表達(dá)，而成人肝臟中表達(dá)關(guān)閉，因而在成人正常組織不表達(dá)或低水平表達(dá)。最近研究發(fā)現(xiàn)，GPC-3在肝細(xì)胞肝癌中異常表達(dá)，與原發(fā)性肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在腫瘤細(xì)胞增殖、分化、黏附和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[14]，可作為診斷HCC的特異性和靈敏性腫瘤標(biāo)志物[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，GPC-3在HCC與癌旁組織表達(dá)率為73.56%與2.86%，在ICC組織表達(dá)率為2.5%，不僅與癌旁組織差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且在與ICC的鑒別診斷中具有重要價值。另外，GPC3的表達(dá)情況與患者臨床分期及預(yù)后判斷也密切相關(guān)。Chen等[16]研究發(fā)現(xiàn)GPC3陽性的肝癌患者5年生存率顯著低于GPC3陰性表達(dá)的患者（27%vs62%，P=0.0036），認(rèn)為GPC3表達(dá)情況與肝癌患者預(yù)后密切相關(guān)；Xue等[17]發(fā)現(xiàn)，肝癌組織GPC3表達(dá)與其腫瘤分級、臨床病理分期及血管侵犯相關(guān)，是一種可用于預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移、侵襲及生存期的潛在腫瘤血清標(biāo)志物[18]。本組資料GPC3在不同病理分化程度HCC組織表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與上述研究的結(jié)果一致。

Wnt/β-cateninn通路信號傳導(dǎo)通路在細(xì)胞正常發(fā)育過程和腫瘤發(fā)生發(fā)展具有重要作用。尹壽新等[19]研究證明，HepG2細(xì)胞在過度活化時可以誘導(dǎo)Wnt經(jīng)典靶基因的表達(dá)，抑制Wnt/β-cateninn通路可以起到抗腫瘤的效果[20]。目前已發(fā)現(xiàn)多種分泌蛋白在調(diào)控Wnt/β-cateninn通路上發(fā)揮重要作用，GPC3就是其中之一。本實驗也發(fā)現(xiàn)β-catenin及GPC3蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，推測GPC3在Wnt/β-cateninn通路上發(fā)揮重要作用。但β-catenin及GPC3與GS表達(dá)均未見明顯相關(guān)性（P＞0.05）。

圖1 β-catenin癌旁肝組織包膜弱陽性，癌組織膜漿同時陽性（EnVision兩步法 ×10）

圖2 GS在正常肝組織內(nèi)及癌旁表達(dá)于終末肝靜脈周圍的肝細(xì)胞（EnVision兩步法 ×10）

圖3 GS在肝癌中彌漫成片表達(dá)（EnVision兩步法×20）

圖4 GPC3在肝癌中的表達(dá)，周圍癌旁組織未見陽性表達(dá)（EnVision兩步法 ×20）

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