王 佶 胡權(quán)騰 何忠良朱成楚何雪明 辛順心 伍勇勇

目前細(xì)胞移植治療心臟疾病越來(lái)越受到人們的重視，隨著研究的深入，已有一些應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究報(bào)道，但如何促進(jìn)更多的移植細(xì)胞游走到組織間隙來(lái)提高其療效已成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)[1-5]。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）作為血管通透劑對(duì)缺血性心臟病有一定的療效，但是否對(duì)移植細(xì)胞的遷移有影響報(bào)道極少[6]。本研究觀察VEGF預(yù)處理對(duì)正常灌注與缺血再灌注模型下大鼠離體心臟BMSCs滯留率的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2周齡清潔級(jí)雄性SD大鼠20只作為BMSCs的來(lái)源，12周齡清潔級(jí)近交系雌性SD大鼠106只，體質(zhì)量（210.83±12.5）g制備離體心臟正常灌注和缺血再灌注模型，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證：SCXK（浙）2014-0001。所有大鼠均在相同的條件下飼養(yǎng)，人工光照明、暗各12h/d。

1.2 主要試劑和儀器 Langendorff心臟離體灌注裝置、pH計(jì)（美國(guó)Beckman）；高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Hermle）；倒置相差/熒光顯微鏡（日本 Olympus公司）；Countess自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（Invitrogen Proprietary公司）；Genomic DNA Purification Kit（PromegaWizard公司）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS緩沖液（美國(guó)GibcolBRL公司）；PCR試劑盒（北京易萊西諾生物科技有限公司）；PCR引物（美國(guó)invitrogen公司），7300 Real-time PCR System（ABI公司）；小鼠抗大鼠 CD29、CD34、CD44、CD45 和CD106 的單克隆抗、VEGF、DAPI（Sigma 公司，批號(hào)SAB4700294、SAB1403649、SAB1405590、SAB4700471、SAB1305520、SRP6255、D9542）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 大鼠BMSCs分離、培養(yǎng)和鑒定 取2周齡清潔級(jí)雄性SD大鼠20只，氯胺酮30mg/kg、安定5mg/kg腹腔注射麻醉,無(wú)菌條件下取出股骨和脛骨，用DMEM培養(yǎng)基緩慢沖洗骨髓腔，沖洗出來(lái)液體離心收集細(xì)胞，接種到含DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置37°C、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，原代培養(yǎng)24～48h后換液，細(xì)胞長(zhǎng)滿70～80%融合時(shí)按1：3傳代，3代以后的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)；用倒置顯微鏡觀察第3代BMSCs的形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原CD29、CD34、CD44、CD45 和 CD106 的 表 達(dá) ，用Countess自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀記錄活細(xì)胞總數(shù)。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組與模型構(gòu)建 （1）大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分成正常灌注組與缺血再灌注組，每組50只，其中正常灌注組又分成BMSCs組（n=25）與 BMSCs+VEGF組（n=25），缺血再灌注組也分成BMSCs組（n=25）與BMSCs+VEGF組（n=25）。（2）正常灌注組中BMSCs組大鼠給予戊巴比妥鈉（30mg/kg）腹腔注射麻醉、肝素（250U/kg）抗凝，快速顯露，保留3～4mm主動(dòng)脈剪下心臟，將灌注管固定在主動(dòng)脈端，連接離體心臟灌注系統(tǒng)，灌注液流量約8mL/min，待心臟穩(wěn)定搏動(dòng)15min后，注入BMSCs細(xì)胞 1mL（1×106/mL），停 2min 后重新開始灌注，于 5、10、30、60、120min 時(shí)間點(diǎn)收集從心臟流出的所有灌注液，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5只。注入高鉀停跳液使心臟在舒張期停跳后，取出心臟，放入液氮中存儲(chǔ)。BMSCs+VEGF組灌注BMSCs前預(yù)先向心臟中注入VEGF1mL（濃度 1000μmol/L），其他步驟與 BMSCs組相同。（3）缺血再灌注組先建立心臟離體灌注模型，待心臟穩(wěn)定搏動(dòng)15min后，關(guān)閉灌注系統(tǒng)使心肌缺血30min，建立缺血再灌注模型，其他操作步驟與正常灌注組相同，見表1。

2.3 測(cè)定 BMSCs滯留率 （1）RT-PCR檢測(cè)：從BMSCs中提取的DNA按梯度制成細(xì)胞數(shù)-CT值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。把備用的心臟制成10%組織勻漿，用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)量OD260/280比值，判定DNA的質(zhì)量，計(jì)算濃度；（2）RT-PCR擴(kuò)增：SRY上游引物：5’-3’CATCGAAGGGTTAAAGTGCCA，下游引物：5’-3’ATAGTGTGTAGGTTGTTGTCC。每個(gè)樣品含量:10uL的目標(biāo) DNA，上下游引物各 1μL，12.5μL的Power：SYBR Green PCR Master Mix 和 0.5μL 的DEPC水。循環(huán)條件是：95℃預(yù)變性10min，95℃變性15s，60℃退火 1min，每個(gè)樣本重復(fù) 3 次，7300 Realtime PCR System檢測(cè)SRY目標(biāo)基因。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（s） 表示。各組內(nèi)5個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較采用配伍組設(shè)計(jì)方差分析；兩兩組間比較采用t檢驗(yàn)和秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠BMSCs分離培養(yǎng)和鑒定 形態(tài)學(xué)觀察：采用貼壁法，通過(guò)換液、培養(yǎng)去除不貼壁細(xì)胞，細(xì)胞長(zhǎng)到培養(yǎng)瓶面積70%可進(jìn)行第1次傳代，開始細(xì)胞形態(tài)不一，主要為圓形、梭形、紡錘形、多角形。經(jīng)過(guò)3次傳代后純化，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形纖維狀，生長(zhǎng)均勻，形態(tài)趨于一致。每個(gè)培養(yǎng)瓶可收集到BMSCs（1.8±0.3）×106個(gè)，平均細(xì)胞直徑為17.2μm。經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定計(jì)數(shù)，其中 CD34、CD45 表達(dá)陰性，CD29、CD44、CD106表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞占95%以上，分離培養(yǎng)后的細(xì)胞具有較高的純度；用Countess自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)可計(jì)算出BMSCs的活性，傳至第3代的BMSCs細(xì)胞活性接近100%，

3.2 動(dòng)物模型建立 取大鼠106只，其中在手術(shù)中損傷心臟1只，主動(dòng)脈根部破裂1只，心臟提前停止跳動(dòng)4只，其余均在1min內(nèi)取下心臟并懸掛至Langendorff裝置，成功建立大鼠心臟離體灌注模型，成功率94.3%。

3.3 PCR檢測(cè)結(jié)果 從BMSCs中提取的DNA經(jīng)101～105倍稀釋后獲得每個(gè)濃度的CT值，制成細(xì)胞數(shù)-CT值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，推算出細(xì)胞數(shù)量的計(jì)算公式：細(xì)胞數(shù)=10（31.49-Ct）/3.2412。滯留率=心臟內(nèi)滯留的細(xì)胞量/灌注細(xì)胞總量，心臟內(nèi)滯留的細(xì)胞量通過(guò)RT-PCR 計(jì)算得出：（1）正常灌注 BMSCs組在 5、15、30、60、120min五個(gè)時(shí)間點(diǎn)平均BMSCs滯留率之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），這說(shuō)明BMSCs的滯留主要發(fā)生在細(xì)胞注射后的5min之內(nèi)，之后減少不明顯；（2）缺血再灌注組與正常灌注組各同一時(shí)間點(diǎn)的平均BMSCs滯留率比較，缺血再灌注組均顯著高于正常灌注 BMSCs組（P 均＜0.05）；（3）正常灌注 BMSCs+VEGF組與正常灌注BMSCs組各同時(shí)間點(diǎn)滯留率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；缺血再灌注BMSCs+VEGF組與缺血再灌注BMSCs組各同時(shí)間點(diǎn)滯留率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；（4）缺血再灌注BMSCs+VEGF組與正常灌注BMSCs+VEGF組同時(shí)間點(diǎn)比較，滯留率均明顯增加（P均＜0.05），見表 2。

4 討論

BMSCs是骨髓中的一種具有自我更新和多向分化能力的多功能非造血干細(xì)胞，它可以通過(guò)在體外分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增獲得較多的細(xì)胞數(shù)并仍有分化的潛能，在特定條件下可分化為軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞等多種組織細(xì)胞，對(duì)損傷組織有顯著的修復(fù)功能，并且具有獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)特性（免疫抑制）和極低的免疫原性（免疫赦免）等重要的生物學(xué)特性[7-8]。這些特點(diǎn)有可能使BMSCs移植治療心臟疾病成為切實(shí)而有效的治療方法，而BMSCs的歸巢和滯留對(duì)于細(xì)胞移植的治療效果至關(guān)重要。

表1 各組大鼠干預(yù)處理情況

表2 各組大鼠離體心臟不同時(shí)間點(diǎn)BMSCs滯留率（%，±s）

表2 各組大鼠離體心臟不同時(shí)間點(diǎn)BMSCs滯留率（%，±s）

注：與正常灌注組BMSCs比較，*P＜0.05；與正常灌注BMSCs+VEGF組比較，△P＜0.05；BMSCs：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；VEGF：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

組別正常灌注BMSCs組正常灌注BMSCs+VEGF組缺血再灌注BMSCs組缺血再灌注BMSCs+VEGF組鼠數(shù)25 25 25 25 5min 16.32±3.84 19.38±4.66 36.96±4.79*41.46±5.88*△10min 14.02±5.23 19.54±5.11 35.88±4.76*37.82±5.74*△30min 12.48±3.46 16.68±2.64 28.05±3.46*32.82±3.53*△60min 12.42±3.61 16.06±2.12 27.04±6.35*33.24±6.19*△120min 12.42±3.49 15.60±2.00 27.06±5.84*31.60±3.26*△

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)大鼠離體心臟正常灌注下BMSCs滯留率，發(fā)現(xiàn)注入心臟后BMSCs滯留大部分發(fā)生在5min內(nèi)，之后幾乎所有細(xì)胞被沖出心臟，滯留率較低，在16.32%左右，與Amado等[9]追蹤BMSCs移植后的結(jié)果相同。同時(shí)發(fā)現(xiàn)大鼠離體心臟缺血再灌注可以顯著增加BMSCs的滯留率，達(dá)到36.96%，原因是心肌缺血會(huì)對(duì)一些信號(hào)分子產(chǎn)生應(yīng)答激活，損傷部位釋放趨化因子、黏附分子、生長(zhǎng)因子和酶等多種配體，與BMSCs上表達(dá)的相應(yīng)受體結(jié)合，驅(qū)動(dòng)BMSCs遷移到受損部位的作用[10-11]。Mangi等[12]用大鼠心肌梗塞模型，上調(diào)BMSCs的ATk基因表達(dá)后注入心臟發(fā)現(xiàn)細(xì)胞移植的治療效果要明顯好于對(duì)照組，因?yàn)樵鰪?qiáng)細(xì)胞對(duì)低氧的耐受，減少細(xì)胞凋亡，提高BMSCs的存活率。有研究表明，將過(guò)表達(dá)PKCε基因的BMSCs注入急性心肌梗死大鼠模型的心臟后，BMSCs在心肌的滯留率和存活率明顯提升，并改善心室重塑和心臟功能，且這種效應(yīng)在抑制CRCR4和PI3K后依然存在，PKCε基因的過(guò)表達(dá)可以激活SDF-1/CXCR4軸和PI3K/AKT信號(hào)通路，兩者在間充質(zhì)干細(xì)胞的歸巢過(guò)程中起重要作用[13]。

VEGF是體內(nèi)一種強(qiáng)效促血管生成因子，也是一種強(qiáng)效血管通透劑。雖然VEGF和BMSCs各自治療心臟缺血性疾病的有許多報(bào)道，但兩者聯(lián)合應(yīng)用是否有協(xié)同作用的報(bào)道卻并不多見。鑒于此，有學(xué)者將轉(zhuǎn)染VEGF基因的MSCs移植于心肌梗死區(qū)域后，MSCs可在心肌梗死區(qū)順利存活，實(shí)驗(yàn)組毛細(xì)血管數(shù)量顯著高于對(duì)照組，心功能改善程度也優(yōu)于對(duì)照組[14]。Wang等[15]通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，VEGF通過(guò)激活FAK和Rac1信號(hào)分子促進(jìn)BMSCs遷移，且這種效應(yīng)在BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞方向預(yù)誘導(dǎo)分化24h后最明顯，而在心肌細(xì)胞中尚未見報(bào)道。本研究中正常灌注BMSCs組與正常灌注BMSCs+VEGF組大鼠離體心臟BMSCs滯留率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；缺血再灌注BMSCs組和缺血再灌注BMSCs+VEGF組大鼠高體心臟BMSCs滯留率差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明VEGF作為血管通透劑對(duì)提高BMSCs滯留率可能無(wú)明顯作用，不能促使更多的細(xì)胞進(jìn)入組織間隙，分析原因可能一是大鼠離體心臟經(jīng)VEGF預(yù)處理后，立即開始灌注BMSCs，VEGF沒有起作用的緩沖時(shí)間，影響了其療效，二是VEGF的生物半衰期比較短，注入體內(nèi)易稀釋，而且缺血受損組織會(huì)釋放某些生物因子，刺激BMSCs分泌促血管生成因子VEGF影響微血管。因此，一次性注入外源性VEGF可能對(duì)整個(gè)滯留過(guò)程影響并不大。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道，將BMSCs移植到受損心肌后是通過(guò)提高血管新生，增加血供和營(yíng)養(yǎng)支持來(lái)發(fā)揮修復(fù)受損心肌的作用，這種作用依賴于胎盤生長(zhǎng)因子（PLGF），而不是如經(jīng)典學(xué)說(shuō)認(rèn)為的那樣大量分化為心肌細(xì)胞，以此來(lái)替代受損的細(xì)胞[16]，也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)外源性補(bǔ)充VEGF對(duì)BMSCs的血管再生效應(yīng)有抑制作用[17]。

總之，缺血再灌注可以顯著增加大鼠離體心臟的BMSCs滯留率，而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）對(duì)其無(wú)明顯增加作用，在受損心肌中是否有作用有待進(jìn)一步深入研究。

［1］ Schachinger V，Erbs S，Elsasser A，et al.Intracoronary bone marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction［J］.N Engl J Med，2006，355（12）：1210-1221.

［2］ Roncalli J，Mouquet F，Piot C，et al.Intracoronary autologous mononucleated bone marrow cell infusion for acute myocardial infarction：results of the randomized multicenter BONAMI trial［J］.Eur Heart J，2011，32（14）：1748-1757.

［3］Furlani D，Ugurlucan M，Ong L，et al.Is the intravascular administration of mesenchymal stem cells safe Mesenchymal stem cells and intravital microscopy［J］.Microvasc Res，2009，77（3）：370-376.

［4］ Hare JM，F(xiàn)ishman JE，Gerstenblith G，et al.Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy：the POSEIDON randomized trial［J］.JAMA，2012，308（22）：2369-2379.

［5］Trachtenberg B，Velazquez DL，Williams AR，et al.Rationale and design of the Transendocardial Injection of Autologous Human Cells（bone marrow or mesenchymal）in Chronic Ischemic Left Ventricular Dysfunction and Heart Failure Secondary to Myocardial Infarction （TAC-HFT）trial：A randomized，double-blind，placebo-controlled study of safety and efficacy［J］.Am Heart J，2011，161（3）：487-493.

［6］ Tao ZX，Chen B，Tan X，et al.Coexpression of VEGF and angiopoietin-1 promotes angiogenesis and cardiomyocyte proliferation reduces apoptosis in porcine myocardial infarction（MI）heart［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2011，108（5）：2064-2069．

［7］Liu X，Chen T，Wu Y，et al.Role and mechanism of PTEN in adiponectin-induced osteogenesis in human bone marrow mesenchymal stem cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2016，12（29）：712-717.

［8］Emmert MY，Weber B，Wolint P，et al.Intramyocardial transplantation and tracking of human mesenchymal stem cells in a novel intra-uterine preimmune fetal sheep myocardial infarction model：a proof of concept study［J］.Plos One，2013，8（3）：e57759．

［9］ Amado LC，Saliaris AP，Schuleri KH，et al.Cardiac repair with intramyocardial injection of allogeneic mesenchymal stem cells after myocardial infarction［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102（32）：11474-11479.

［10］高立華，張旭華.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)缺血再灌注大鼠急性心肌梗死保護(hù)作用研究［J］．現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2013，28（6）：78-81.

［11］ Singh A，Singh A，Sen D.Mesenchymal stem cells in cardiac regeneration：a detailed progress report of the last 6 years（2010-2015）［J］.Stem Cell Res Ther，2016，7（1）：82.

［12］ Mangi AA，Noiseux N，Kong D，et al.Mesenchymal stem cells modified with Akt prevent remodeling and restore performance of infarcted hearts［J］.Nat Med，2013，9（9）：1195-1201.

［13］ He H，Zhao ZH，Han FS，et al.Overexpression of protein kinase C varepsilon improves retention and survival of transplanted mesenchymal stem cells in rat acute myocardial infarction［J］.Cell Death Dis，2016，7：e2056.

［14］楊鍇，陳剛，楊飛燕，等.VEGF基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療對(duì)心肌梗死大鼠的影響［J］.廣東醫(yī)學(xué)，2013，34（3）：362-364.

［15］ Wang H，Wang X，Qu J，et al.VEGF Enhances the Migration of BMSCs in Neural Differentiation by Regulating Focal Adhesion Turnover［J］.J Cell Physiol，2015，230（11）：2728-2742.

［16］Zhang J，Wu Y，Chen A，et al.Mesenchymal stem cells promote cardiac muscle repair via enhanced neovascularization［J］.Cell Physiol Biochem，2015，35（3）：1219-1229.

［17］ Niyaz M，Gurpinar OA，Oktar GL，et al.Effects of VEGF and BMSCs on vascular regeneration in a trauma model in rats［J］.Wound Repair Regen，2015，23（2）：262-267.