李濤

摘 要：植物根際促生菌因其能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)、防治病害的優(yōu)勢(shì)日益受到廣泛關(guān)注，其研究主要集中在假單胞菌類，假單胞菌類在植物根際的定殖主要與趨化作用相關(guān)。本研究通過生物信息學(xué)軟件對(duì)惡臭假單胞菌UW4的甲基趨化受體蛋白（MCPs）進(jìn)行篩選，然后對(duì)其進(jìn)行克隆和表達(dá)，結(jié)果表明：克隆得到的MCP1可穩(wěn)定表達(dá)，通過對(duì)惡臭假單胞菌UW4的甲基趨化受體蛋白的純化及分析其與不同配體物質(zhì)的熱力學(xué)作用強(qiáng)弱，以期找出惡臭假單胞菌特異性的趨化受體，進(jìn)一步闡明其趨化機(jī)理，為惡臭假單胞菌對(duì)植物的促生效應(yīng)提供理論支撐。

關(guān)鍵詞：植物根際促生菌；趨化；ACC 脫氨酶；MCP；SDS-PAGE

中圖分類號(hào)：Q785 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.05.001

Abstrac： The plant growth-promoting rhizosphere bacteria became more and more striking because it could promote the growth， prevent and treat diseases of plant. These researches mainly concentrated on the Pesudomonas. Pesudomonas colonization in plant rhizosphere was related to chemotaxis. This study screened the methyl chemotaxis receptor proteins （MCPs） of Pesudomonas UW4 by using several bioinformatics software， and then cloned and expressed the MCPs. The result showed that the cloned MCP1 could express stably， through the purification of the methyl chemotaxis receptor proteins of Pseudomonas UW4 and analysis the thermodynamic effect of the different ligands with MCPs， we could find out the specificity chemotaxis receptors of Pesudomonas UW4， clarify its chemotaxis mechanism and give some theoretical supporting to the growth-promoting of plant.

Key words： plant growth-promoting rhizosphere bacteria； chemotaxis； ACC deaminase； methyl chemotaxis receptor protein； SDS-PAGE

綠色農(nóng)業(yè)概念的提出源于我國(guó)綠色食品產(chǎn)業(yè)約二十年長(zhǎng)足發(fā)展的豐富實(shí)踐。事實(shí)證明，綠色農(nóng)業(yè)是符合我國(guó)國(guó)情、適合現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展新形勢(shì)的可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展形態(tài)與模式。農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展強(qiáng)調(diào)逐步減少化肥用量，大力發(fā)展農(nóng)業(yè)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)。植物根際促生菌（Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）因其能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)、防治病害的優(yōu)勢(shì)日益受到廣泛關(guān)注[1]，其研究主要集中在假單胞菌類，該類群能夠抑制多種植物病害特別是土傳病害的發(fā)生[2]，相關(guān)研究?jī)?nèi)容主要涵蓋有效根部定殖、抗生作用、根圍營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、分泌降解病原微生物的酶等方面。有研究表明，假單胞菌 CHA0 能在鐵素缺乏的條件下自然產(chǎn)生水楊酸（Salicylic acid，SA），同時(shí)還可提高煙草（Nicotiana tabacum）對(duì)煙草花葉病毒的抵抗能力[3]。假單胞菌屬（Pseudomonas）還可產(chǎn)生氫氰酸抑制病原真菌根串珠霉（ Thielaviopsis basicola） 引起的煙草黑根病；可分解萎蔫酸進(jìn)而減輕植物受害程度[2]；還可噴施于蘑菇和經(jīng)濟(jì)林植物，可防治霜霉病、托拉斯假單胞桿菌（Pseudomonas tolaasii） 等各種病害[4]。

許多PGPR均含有ACC（一氨基環(huán)丙烷一羧酸）脫氨酶基因，能夠合成 ACC 脫氨酶，利用土壤內(nèi)的ACC作為氮源，將ACC水解成氨和α-丁酮酸[5]，從而抑制乙烯的合成，以此解除乙烯對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的抑制作用。本課題組長(zhǎng)期對(duì)假單胞菌屬中的惡臭假單胞菌UW4進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)此菌亦含有ACC 脫氨酶，可與植物形成緊密的互惠關(guān)系。促使PGPR在植物根部定殖的主要因素有兩個(gè)：一是PGPR在與土著微生物的競(jìng)爭(zhēng)中取得優(yōu)勢(shì)；二是趨化作用，即白細(xì)胞沿濃度梯度向著化學(xué)刺激物作定向移動(dòng)，正是由于植物根系源源不斷地分泌各種趨化物質(zhì)，使得PGPR向根部游動(dòng)并最終定殖下來。

假單胞菌屬的趨化信號(hào)通路與類球紅細(xì)菌（Rhodobacter sphaeroides）相似，除了具有處于細(xì)胞端部的甲基趨化受體蛋白（MCP）復(fù)合體外，還有一個(gè)位于細(xì)胞質(zhì)的受體復(fù)合體，鞭毛的運(yùn)動(dòng)同時(shí)受二者調(diào)控。惡臭假單胞菌F1的一個(gè)MCP蛋白能夠與三羧酸循環(huán)中的6個(gè)中間產(chǎn)物結(jié)合，對(duì)蘋果酸、延胡索酸、草酰乙酸和琥珀酸有高的親和力，并能產(chǎn)生強(qiáng)趨化反應(yīng)，表明MCP對(duì)趨化物的親和力與趨化反應(yīng)強(qiáng)度有關(guān)[6]。

本研究通過生物信息學(xué)軟件對(duì)惡臭假單胞菌UW4的MCP進(jìn)行篩選，采用拓?fù)鋵W(xué)軟件TOPCONS分析其是否具有跨膜結(jié)構(gòu)域；采用NCBI中保守域軟件Conserved Domain 分析其是否具有HAMP（Histidine Kinases， Acdenylyl cyclases， Methy binding proteins， Phosphatases）及MCP-signal結(jié)構(gòu)域，采用Phyre2.server軟件分析其N-末端是否具有配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（LBD），符合以上3個(gè)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的推測(cè)其可能為一個(gè)MCP，并對(duì)此MCP1進(jìn)行了克隆和表達(dá)研究。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌株：惡臭假單胞菌UW4（本實(shí)驗(yàn)室保藏）。

菌種傳代及培養(yǎng)：LB液體及固體培養(yǎng)基。

克隆及表達(dá)載體：北京全式金生物pEASY-Blunt E1 Expression Kit； SanPrep 柱式質(zhì)粒DNA 小量抽提試劑盒，上海生工生物工程有限公司；Pfu DNA polymerase：北京GenStar公司；

引物合成及測(cè)序：華大基因；克隆及表達(dá)菌株：北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司DH5a及BL21（DE3）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 通過對(duì)NCBI中基因組的序列比對(duì)，在UW4中找到一個(gè)登錄號(hào)為WP_015093116.1 ，注釋為甲基受體趨化蛋白methyl-accepting chemotaxis sensory transducer [Pseudomonas sp. UW4]的蛋白質(zhì)，使用TOPCONS軟件分析其是否具有跨膜結(jié)構(gòu)域， NCBI中Conserved Domain 分析其是否具有HAMP及MCP-signal domain；使用Phyre2 server分析其N-末端是否具有配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（LBD），最終確定其具備以上3個(gè)結(jié)構(gòu)特征，推測(cè)可能為UW4的一個(gè)MCP1。

1.2.2 MCP的克隆及原核表達(dá) 根據(jù)pEASY-Blunt E1 Expression Kit載體特征，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行MCP1平末端片段的克隆，片段長(zhǎng)度為1 917bp，引物序列如表1所示。

將克隆得到的MCP1片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收，連至pEASY-Blunt E1 Expression Kit，采用化學(xué)轉(zhuǎn)化法將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DH5a，挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行陽(yáng)性克隆鑒定，將鑒定成功的pEASY-Blunt E1-MCP1重組質(zhì)粒送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與目的片段同源率為100%。將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株BL21（DE3），挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌液PCR及質(zhì)粒提取鑒定，將鑒定成功的帶有pEASY-Blunt E1-MCP重組質(zhì)粒的BL21（DE3）以1%接種量接至含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，220 rpm搖菌，培養(yǎng)至OD600=0.4～0.6，加入不同濃度（0.1～1.0 mmoL·L-1）的誘導(dǎo)劑IPTG，25 ℃過夜誘導(dǎo)使蛋白表達(dá)。

1.2.3 SDS-PAGE電泳鑒定目的蛋白 （1）樣品制備。取2 mL菌液，12 000 rpm離心2 min后重懸至2 mL PBS 緩沖液中，進(jìn)行細(xì)胞破碎15 min，分出上清和沉淀后，將沉淀重懸至100 μL。將上清和沉淀樣品中分別加入5×上樣緩沖液，混合均勻后將其置于100 ℃沸水浴中煮沸10 min，后取出冷卻放置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

（2）電泳過程。制備好分離膠及濃縮較后組裝好電泳系統(tǒng)，加入電極緩沖液，上樣約10 μL，接好電極開始電泳，開始電場(chǎng)強(qiáng)度為80 V，待染料進(jìn)入分離膠后，將電場(chǎng)強(qiáng)度調(diào)至120 V，繼續(xù)電泳直至染料抵達(dá)分離膠底部，斷開電源。

（3）凝膠的固定及染色。取出膠片，用至少5倍體積的考馬斯亮藍(lán)染色液浸泡凝膠，放在搖床上室溫緩慢旋轉(zhuǎn)約20 min染色，染色完成后將凝膠置于脫色液浸泡，緩慢搖動(dòng)4～8 h脫色，其間更換脫色液2～3次，至凝膠背景透明。將脫色后的凝膠照相或干燥保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 MCP1克隆及測(cè)序

利用表1中的引物進(jìn)行MCP1片段克隆，結(jié)果如圖1所示。

將鑒定成功的pEASY-Blunt E1 Expression Kit-MCP1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子送測(cè)序（圖2），測(cè)序結(jié)果與目的片段同源率達(dá)100%。

2.2 構(gòu)建表達(dá)菌株

將測(cè)序成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌株BL21（DE3），后提取質(zhì)粒鑒定轉(zhuǎn)化是否成功，結(jié)果如圖3所示。

將鑒定成功的表達(dá)菌株BL21（DE3）-MCP1以1%接種量接至含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，220 rpm搖菌，培養(yǎng)至OD600=0.4～0.6，加入不同濃度（0.1～1.0 mmol·L-1）的誘導(dǎo)劑IPTG，25 ℃過夜誘導(dǎo)使蛋白表達(dá)。

2.3 SDS-PAGE電泳結(jié)果

將誘導(dǎo)完成的菌液取2 mL進(jìn)行樣品前處理后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳觀察表達(dá)情況，電泳結(jié)果如圖4和圖5所示。

從上圖4和圖5中可以看出：MCP1在加入誘導(dǎo)劑IPTG 0.5～0.9 mmol·L-1時(shí)誘導(dǎo)效果良好，MCP1表達(dá)量較多，但主要以包涵體形式存在，上清中基本未見表達(dá)。

3 結(jié)論與討論

以上結(jié)果表明：克隆得到的MCP1可穩(wěn)定表達(dá)，但多數(shù)在沉淀中，上清中表達(dá)量偏少。下一步嘗試采用低溫低速誘導(dǎo)方式，使MCP1能夠可溶性表達(dá)并采用固定金屬親和層析法分離純化得到有活性的純蛋白，然后通過等溫滴定（Isothermal titration calorimetry）和熱漂移試驗(yàn)（Fluorescence-based thermal shift assay）分析MCPs與各類不同趨化物質(zhì)（配體）之間親和力的大小即熱力學(xué)作用強(qiáng)弱，以期找出惡臭假單胞菌特異性的趨化受體，進(jìn)一步闡明其趨化機(jī)理，為惡臭假單胞菌對(duì)植物的促生效應(yīng)提供理論支撐。

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