尚振華 賈春松 顏 灝 王巨昆 王 旭 崔 波 王 琦 歐彤文

(首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院泌尿外科，北京 100053)

膀胱平滑肌的副交感神經(jīng)調控主要通過神經(jīng)遞質乙酰膽堿作用于膀胱平滑肌細胞(bladder smooth muscle cells，BSMCs)的乙酰膽堿受體發(fā)揮作用。乙酰膽堿M型受體分為5型而BSMCs主要表達M2和M3型[1]。雖然M2受體在數(shù)量上明顯多于M3受體，但是M2受體通過抑制交感神經(jīng)β受體介導的膀胱舒張功能而間接發(fā)揮收縮膀胱的作用[2-3]，而M3受體直接介導膀胱的收縮功能[4-7]。小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)通常含有21～25個核苷酸，它通過與Dicer 酶等復合物的一系列生物化學酶學反應降解同源序列mRNA[8]從而發(fā)揮抑制基因的翻譯、下調目的基因表達的作用。目前廣泛應用的siRNA慢病毒載體是以人類免疫缺陷1型病毒(human immunodeficiency virus-1, HIV-1)為基礎構建的，siRNA慢病毒載體與具有病毒包裝輔助功能的質粒共同轉染293T 細胞后可以獲得靶基因的siRNA慢病毒。慢病毒攜帶siRNA可以穩(wěn)定、高效、持續(xù)地干擾靶細胞目的基因的翻譯過程從而達到下調目的蛋白表達的目的。由于M3受體在膀胱平滑肌收縮中起主要作用，因此，選擇M3受體作為干擾靶點。

本研究擬通過體外原代培養(yǎng)BSMCs，構建M3受體siRNA慢病毒載體，研究siRNA干擾M3受體表達的效果，為下一步探索M3受體基因干擾抑制神經(jīng)源性膀胱患者膀胱過度活動和纖維化的可能性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

雌性Wistar大鼠(220～250 g)，實驗動物使用許可證號：SYXK(京)2017-0033，北京維通利華實驗技術有限公司提供，飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院動物中心SPF級動物房。293T細胞，pHelper 1.0、pHelper 2.0質粒及重組載體GV118購自上海吉凱基因化學技術有限公司。Lipofectamine 2000轉染系統(tǒng)購自美國Invitrogen公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、Ⅳ型膠原酶和青霉素、鏈霉素購自美國Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 體外原代培養(yǎng)大鼠BSMCs

脫頸法處死Wistar大鼠，75%(體積分數(shù))乙醇浸泡5 min，下腹正中切口從膀胱頸部切下膀胱，超凈臺內用100 U/mL慶大霉素浸泡5 min，再在PBS溶液中將黏膜層、黏膜下層和漿膜層除去。將肌層盡可能剪碎后置于0.25%(質量分數(shù))胰酶中37 ℃震蕩消化30 min，1 000 r/min離心5 min，將沉淀置于0.1%(質量分數(shù))Ⅳ型膠原酶中37 ℃震蕩消化30 min。100 目細胞篩過濾后1 000 r/min離心5 min，用含15%(體積分數(shù))胎牛血清、100 U/mL青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基重懸沉淀的細胞，將細胞移入25 mL培養(yǎng)瓶并置于5%(體積分數(shù))CO2、37 ℃飽和濕度的孵育箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)液每2 d更換一次。BSMCs增生達到約80%融合時按1∶4的比例進行傳代。

1.2.2 GV118-sh-M3載體構建及病毒制備

設計4條siRNA干擾靶點如下。M3target 1: GGAAAGAAGGAGAGGCATA；M3target 2:GCAACAGCAAGGCGTGAAA；M3target 3:GGCAATACTTTGTAGGGAA；M3target 4: ACAAACAGCTGAAGACAGT并合成下列寡核苷酸鏈，詳見表1。

表1 siRNA干擾序列Tab.1 siRNA sequence

引物溶于緩沖液中90 ℃水浴15 min，冷卻退火配對產生雙鏈。陰性對照(negative control，NC)慢病毒載體的序列為：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。限制性核酸內切酶雙酶切慢病毒載體GV118后與退火產物連接，將連接產物轉入DH5α感受態(tài)細胞，氨芐西林篩選陽性克隆并測序驗證。測序驗證后分別命名為GV118-sh-M3-1(KD1)、GV118-sh-M3-2(KD2)、GV118-sh-M3-3(KD3)、GV118-sh-M3-4(KD4)和NC-sh-M3(NC)。利用Lipofectamine 2000將pHelper 1.0、pHelper 2.0及4種GV118-sh-M3和NC-sh-M3載體分別共轉染處于對數(shù)生長期的293T細胞，培養(yǎng)8 h后棄掉培養(yǎng)基，PBS洗滌后加入培養(yǎng)基25 mL，培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集293T細胞上清液在4 ℃離心機4 000 g離心10 min。0.45 μm濾器過濾上清后將病毒提取液移入過濾杯中，4 000 g離心10 min，再將過濾杯倒扣在收集杯上800 g離心2 min，收集杯中即為病毒濃縮液。

1.2.3 熒光法測定滴度

將293T細胞種于96孔板，每個孔細胞數(shù)為4×104個，體積為100 μL。準備8個無菌EP管，每個管加入90 μL無血清培養(yǎng)基。將病毒液10 μL加到第1個管，混勻后取10 μL加到第2個管，繼續(xù)相同操作直到最后一個EP管。選取細胞孔，將90 μL培養(yǎng)基棄掉加入90 μL EP管中稀釋的病毒溶液，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后加入完全培養(yǎng)基100 μL，4 d后觀察熒光蛋白表達情況。

1.2.4 慢病毒轉染BSMCs

將5×104的BSMCs懸液接種于12孔板，培養(yǎng)至細胞融合度約為30%。取干擾病毒和NC病毒加入12孔板孔內。每個孔干擾病毒感染復數(shù)(multiply of infection，MOI)值，分別為30、10、l2和12，將未轉染BSMCs作為空白對照。感染12 h后更換培養(yǎng)基，感染24 h后熒光顯微鏡下觀察細胞感染狀況。

1.2.5 RT-PCR檢測M3受體mRNA

收集上述BSMCs，分別提取總RNA，然后進行RT-PCR，M3受體的上游引物為5′-GGCTACTGGCTGTGCTATATC-3′， 下游引物為5′-TCTTGAAGGTGGTTCTGAATGT-3′。磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH)的上游引物為5′-TTCAACGGCACAGTCAAGG-3′， 下游引物為5′-CTCAGCACCAGCATCACC-3′。兩步法進行RT-PCR并制作熔解曲線。根據(jù)各組M3mRNA和GAPDH的原始ct值，2-ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.6 Western blotting法檢測M3受體蛋白表達

收集上述BSMCs, 細胞裂解后離心取沉淀，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后電轉至聚偏氟乙烯膜，用 5%(質量分數(shù))脫脂奶粉封閉4 ℃過夜，M3一抗(1∶1 000)37 ℃溫育2 h，用含0.5% (體積分數(shù))Tween-20的Tris-HCl緩沖液(Tris buffered saline tween，TBST)洗滌 3 次,每次10 min,二抗(1∶2 000)37 ℃溫育1 h，TBST洗滌 3 次,每次10 min, 加入ECL化學發(fā)光試劑進行膠片曝光顯影，Image Pro Plus進行灰度統(tǒng)計。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 測序結果

重組載體測序結果，其干擾序列的峰形圖均為單峰，無突變，說明在重組載體的發(fā)夾結構中序列符合設計序列，詳見圖1。

圖1 基因測序Fig.1 Gene sequencing

A: recombinant vector KD1；B: recombinant vector KD2；C: recombinant vector KD3；D: recombinant vector KD4；KD1: BSMCs transfected by recombinant lentivirus KD1 group;KD2: BSMCs transfected by recombinant lentivirus KD2;KD3: BSMCs transfected by recombinant lentivirus KD3;KD4: BSMCs transfected by recombinant lentivirus KD4；BSMCs： bladder smooth muscle cells.

2.2 慢病毒滴度測定

熒光法測病毒滴度， NC、KD1、KD2、KD3和KD4滴度分別為8×108、2×108、6×108、5×108和5×108TU/mL。

2.3 慢病毒轉染BSMCs

未轉染BSMCs、陰性病毒和干擾病毒轉染BSMCs組熒光蛋白表達量， KD1組熒光蛋白表達量最高，詳見圖2。

圖2 各組BSMCsFig.2 BSMCs in each group (100×)

A:blank control group;B: negative control group;C: BSMCs transfected by recombinant lentivirus KD1 group;D: BSMCs transfected by recombinant lentivirus KD2;E: BSMCs transfected by recombinant lentivirus KD3;F: BSMCs transfected by recombinant lentivirus KD4;BSMCs:bladder smooth muscle cells.

2.4 RT-PCR檢測M3受體mRNA

RT-PCR所得各組相對mRNA水平，KD1組M3受體基因干擾效率達到78.9%，為最符合要求的有效靶點，詳見圖3。

2.5 Western blotting法檢測M3受體蛋白相對表達量

Western blotting測得各組細胞M3受體蛋白相對表達量，KD1組M3受體表達量最低，與陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，詳見圖4。

3 討論

膀胱在儲尿期的調控主要是交感神經(jīng)在發(fā)揮作用，交感神經(jīng)釋放去甲腎上腺素作用于BSMCs的β3受體而使其舒張并作用于膀胱頸口平滑肌的α1受體使其收縮[9-10]；而副交感神經(jīng)節(jié)后神經(jīng)纖維釋放的乙酰膽堿通過作用于BSMCs的M2和M3受體而使膀胱平滑肌收縮[11]。但是M2受體通過抑制交感神經(jīng)β受體介導的膀胱舒張而間接發(fā)揮收縮膀胱的作用[2-3]，而M3受體直接介導膀胱的收縮[4-7]。M3受體是由CHRM3基因編碼的乙酰膽堿毒蕈堿型受體[12]，毒蕈堿型受體主要介導內臟器官平滑肌和上皮的神經(jīng)調控，包括呼吸道、胃腸道和泌尿道[13]。毒蕈堿型受體分為具有不同的功能的5個類型M1～M5。M3受體與Gq蛋白偶聯(lián)發(fā)揮作用，當乙酰膽堿作用于M3受體時，M3受體與Gq蛋白的偶聯(lián)導致磷酸肌醇水解產生三磷酸肌醇(inositol 1,4,5-trisphosphate，IP3)和前列腺素(prostaglandin，PG)，IP3和PG作為信使介導鈣離子內流從而導致逼尿肌收縮[14-15]。

圖3 各組相對mRNA水平Fig.3 mRNA expression of M3 in each group

圖4 各組M3受體蛋白相對表達量Fig.4 Protein expression of M3 in BSMCs in each group

慢病毒為目前常用的基因運輸載體，具有諸多優(yōu)點[16-17]。首先，慢病毒載體具有較高的感染效率，它不僅可以感染分裂細胞，還可以感染非分裂細胞。本研究構建的慢病毒載體干擾效率為78.9%，國內其他研究[18-21]也取得較高的干擾效率，而反轉錄病毒載體轉染效率不及慢病毒[22]。其次，慢病毒載體作用穩(wěn)定且時間長[23]，它可以攜帶目的基因穩(wěn)定的整合進基因組。研究比較了慢病毒載體、腺病毒載體等轉染靶細胞后作用時間，結果顯示腺病毒載體作用時間明顯短于慢病毒載體[22-24]；而且慢病毒載體免疫源性低而具有很好的安全性。慢病毒為剔除毒性基因的假病毒，感染靶細胞后不會再產生新的病毒顆粒。

本研究中慢病毒載體所攜帶的為M3受體siRNA序列。siRNA通過與Dicer 酶等復合物的一系列生物化學酶學反應降解同源序列mRNA[8]。本研究中慢病毒載體為GV118 載體，GV118載體含有HIV基本元件5′LTR和3′LTR以及其他輔助元件，帶有綠色熒光蛋白基因和puro 抗性基團標記；pHelper 1.0中含有分別編碼HIV病毒的主要結構蛋白、病毒特異性酶和調節(jié)gag和pol基因表達調節(jié)因子的基因；pHelper 2.0含有編碼包膜蛋白的基因[25]?；驕y序結果顯示M3受體siRNA序列成功插入GV118 載體并利用Lipofectamine 2000 系統(tǒng)收獲慢病毒。熒光法測得病毒滴度后轉染BSMCs，通過綠色熒光蛋白表達量以及RT-PCR檢測選取干擾效率最高的KD1組病毒進行后續(xù)實驗。

綜上所述，成功包裝并篩選了GV118-sh-M3慢病毒顆粒，為后續(xù)進一步研究干擾M3型受體在神經(jīng)源性膀胱中的作用奠定了基礎。

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