黃語(yǔ)悠 房亞蘭 師文娟 劉克建 趙詠梅

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室 北京市老年病醫(yī)療研究中心 神經(jīng)變性病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 腦血管病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100053)

缺血性腦血管病是導(dǎo)致死亡的重要原因之一，也是導(dǎo)致肢體殘疾的重要因素[1]。腦缺血/再灌注損傷涉及一系列復(fù)雜的病理過(guò)程，但具體目前機(jī)制仍不明確。其中，氧化應(yīng)激損傷在腦缺血再灌注損傷中扮演了重要角色[2]。因此，缺血性卒中的氧化應(yīng)激損傷與腦保護(hù)策略是目前的研究熱點(diǎn)之一[3]。

自噬可以通過(guò)產(chǎn)生游離氨基酸和脂肪酸來(lái)維持細(xì)胞功能，并通過(guò)去除損傷的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)保持細(xì)胞健康，從而使細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)限制條件下存活，是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的一種重要機(jī)制，是細(xì)胞得以保持健康的重要原因之一[9-10]。然而，過(guò)量的自噬也會(huì)導(dǎo)致過(guò)度的自我消化或引發(fā)細(xì)胞凋亡而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[10-11]。研究者[12]認(rèn)為神經(jīng)元死于缺血性損傷后的壞死或凋亡。然而，新的研究[13]表明，缺血再灌注也可以激活自噬性細(xì)胞死亡，而NO在多種細(xì)胞中被證實(shí)對(duì)自噬信號(hào)產(chǎn)生了不同的影響，NO通過(guò)上調(diào)自噬來(lái)防止I/R誘導(dǎo)的肝損傷，但同時(shí)，也有研究[14]顯示NO可以造成缺血再灌注后的腦損傷與心肌損傷。血管再通是目前針對(duì)缺血性卒中最有效的治療方法，氧化應(yīng)激和自噬在缺血再灌注過(guò)程中發(fā)揮的作用對(duì)于缺血性卒中的治療和預(yù)后有著重要意義。本課題組[7]前期研究顯示延遲并減弱NO產(chǎn)生可對(duì)大腦缺血再灌注損傷產(chǎn)生保護(hù)作用，但自噬在其中扮演了怎樣的角色目前尚不明確。因此，本研究采用大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion， MCAO) 再灌注模型大鼠，觀察一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)抑制劑(Nω-nitro-L-arginine methyl ester, L-NAME)對(duì)大鼠腦缺血再灌注后24 h NO和自噬相關(guān)蛋白LC3B和Beclin1的表達(dá)產(chǎn)生的影響，從而進(jìn)一步探討NO在腦缺血再灌注過(guò)程中扮演的角色，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量280～320 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京) 2012-0001，于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室恒溫飼養(yǎng)，術(shù)前12 h禁食水。將18只大鼠采用數(shù)字表法隨機(jī)分為3組：假手術(shù)(Sham)組；MCAO組；MCAO+L-NAME組。L-NAME溶于0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液中，于術(shù)前30 min腹腔注射給藥(1 mg/kg)，Sham組和MCAO組小鼠腹腔注射同等體積的0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液。

1.2 主要儀器設(shè)備

小動(dòng)物麻醉機(jī)(Harvard Apparatus公司，美國(guó))、手術(shù)顯微鏡(Carl Zeiss公司，德國(guó))、反饋式溫度調(diào)節(jié)儀(CMA 150 Carnegie Medicin公司瑞典)、小動(dòng)物呼吸機(jī)(Harvard Apparatus 683，Harvard Apparatus公司，美國(guó))雙極電凝器(德威，DEVEL，ACC100)、冰凍切片機(jī)(Thermo Fisher Scientific公司，美國(guó))、熒光顯微鏡(Nikon公司，日本)。

1.3 試劑

恩氟烷(河北一品制藥有限公司)；水合氯醛(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院)；L-NAME(Sigma公司，美國(guó))；3-NT抗體(Abcam公司，英國(guó))；NeuN抗體(Millipore公司，美國(guó))；LC3B抗體(CST公司，美國(guó))等。

1.4 動(dòng)物模型制作

MCAO大鼠模型按照改良Zea Longa法制備。將恩氟烷混合于70%(體積分?jǐn)?shù)) N2O、30%(體積分?jǐn)?shù)) O2中，用5%(體積分?jǐn)?shù))恩氟烷誘導(dǎo)麻醉后改用面罩吸入2%(體積分?jǐn)?shù))恩氟烷維持麻醉。于大鼠頸部沿正中線切口，分離右側(cè)的頸總動(dòng)脈、結(jié)扎并凝斷頸外動(dòng)脈，將頭端直徑為0.38 mm的尼龍線栓自頸外動(dòng)脈殘端插進(jìn)頸內(nèi)動(dòng)脈，到達(dá)距頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈分叉約18 mm處。術(shù)中檢測(cè)大鼠心率、血壓，并使用反饋性控溫毯監(jiān)測(cè)術(shù)中大鼠肛溫，維持體溫在 (37.0±0.5)℃。缺血90 min后，將線栓拔出進(jìn)行再灌注。術(shù)后大鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，自由進(jìn)食飲水。

1.5 免疫熒光雙標(biāo)

各組大鼠于再灌注后24 h，用水合氯醛腹腔注射麻醉后，快速斷頭取腦，包埋冰凍，行連續(xù)冰凍切片(厚度為20 μm)。首先將腦組織冰凍切片經(jīng)4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛固定10 min，PBS洗后，用含有0.2%(體積分?jǐn)?shù)) TritonX-100的PBS孵育約10 min，PBS洗后，用5 %(體積分?jǐn)?shù))的山羊血清在室溫下封閉30 min，滴加一抗(3-NT 1∶400， LC3B 1∶400，Beclin1 1∶400)，4 ℃孵育一抗過(guò)夜。次日將切片取出，PBS洗后，滴加熒光二抗(1∶300)，在室溫下避光孵育1 h。PBS洗后，最終用DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole)封片。在熒光顯微鏡下觀察。陰性對(duì)照組用PBS代替一抗。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 L-NAME抑制MCAO 大鼠腦缺血半暗帶區(qū) LC3B的表達(dá)

免疫熒光染色結(jié)果顯示，Sham組大鼠大腦中與缺血半暗帶相對(duì)應(yīng)的腦區(qū)偶見(jiàn)LC3B陽(yáng)性的紅色熒光染色，而MCAO組大鼠缺血側(cè)額顳葉皮質(zhì)及紋狀體可見(jiàn)大量LC3B陽(yáng)性細(xì)胞。與Sham組相比，MCAO組大鼠LC3B陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增多；與MCAO組相比，L-NAME組大鼠缺血半暗帶區(qū)LC3B陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯減少(圖1 A)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1 B)。

2.2 L-NAME抑制MCAO大鼠缺血半暗帶區(qū)Beclin1的表達(dá)

免疫熒光結(jié)果顯示，Sham組大鼠腦組織有少量Beclin1蛋白陽(yáng)性細(xì)胞，散見(jiàn)于海馬區(qū)與額頂顳葉皮質(zhì)。MCAO組大鼠腦組織于鏡下可見(jiàn)大量紅色熒光，大腦缺血半暗帶區(qū)Beclin1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較Sham組明顯增高。L-NAME組大鼠腦組織切片缺血半暗帶區(qū)Beclin1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較MCAO組明顯減少(圖2 A)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2 B)。

圖1 L-NAME抑制大鼠再灌注24 h腦缺血半暗帶區(qū)與3-NT相關(guān)的Beclin1表達(dá)Fig.1 Nω-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) inhibits the production of 3-nitrotyrosine (3-NT)-related Beclin1 in the ischemic penumbra of cortices of middle cerebral artery occlusion (MCAO) rats 24 h after reperfusion

圖2 L-NAME降低大鼠再灌注24 h腦缺血半暗帶區(qū)與3-NT相關(guān)的LC3B表達(dá)Fig.2 Nω-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) inhibits the expression of 3-nitrotyrosine (3-NT)-relatedLC3B in the penumbra of middle cerebral artery occlusion (MCAO)rats at 24 h after reperfusion

2.3 大鼠腦缺血半暗帶區(qū)LC3B、Beclin1分別與3-NT共定位

通過(guò)免疫熒光雙標(biāo)可見(jiàn)，LC3B和Beclin1陽(yáng)性細(xì)胞均呈紅色熒光，3-NT陽(yáng)性細(xì)胞為綠色熒光，細(xì)胞核染色為藍(lán)色熒光。合并圖像后，綠色熒光與紅色熒光重合，說(shuō)明LC3B和Beclin1與3-NT共定位，提示缺血再灌注后LC3B與Beclin1蛋白表達(dá)量的增加與NO的過(guò)量產(chǎn)生具有相關(guān)性(圖1、2)。

3 討論

腦缺血后的神經(jīng)損傷機(jī)制十分復(fù)雜，因此至今仍缺乏針對(duì)病因的有效治療[1]。氧化應(yīng)激是腦缺血再灌注過(guò)程中神經(jīng)損傷的重要因素，其與神經(jīng)元凋亡之間的關(guān)系一直是腦保護(hù)劑研究的重點(diǎn)方向[3]。近年來(lái)，有研究[14]顯示，除了神經(jīng)元凋亡，神經(jīng)元的自噬性細(xì)胞死亡與氧化應(yīng)激損傷之間也有著密切的聯(lián)系，可能是腦缺血損傷產(chǎn)生的一個(gè)重要因素。NO與自噬的相關(guān)性在心血管疾病中的研究較多，但其在腦血管疾病中的關(guān)系目前仍存在爭(zhēng)議，有研究[13]認(rèn)為自噬通過(guò)吞噬受損細(xì)胞器緩解缺血再灌注引起的氧化應(yīng)激損傷；但也有研究[11,14]觀察到NO與自噬具有協(xié)同作用，加重缺血再灌注損傷。本研究通過(guò)腹腔注射NOS抑制劑L-NAME抑制缺血再灌注后大鼠腦內(nèi)NO的產(chǎn)生，觀察NO的產(chǎn)生是否影響大鼠腦內(nèi)自噬的激活，以探究NO與自噬的直接關(guān)系。

腦缺血、缺氧后多種信號(hào)分子參與了自噬激活[13]。作為調(diào)控自噬小體合成的上游蛋白，Beclin1是自噬小體形成過(guò)程必不可少的分子，對(duì)檢測(cè)組織內(nèi)自噬作用有著重要的意義[11]。已知上調(diào)Beclin1的表達(dá)可以激活自噬作用，體外培養(yǎng)的Beclin1缺失的細(xì)胞自噬減少。在自噬形成的初始階段[9]，Beclin1通過(guò)與PI3K形成復(fù)合體調(diào)節(jié)自噬相關(guān)基因(autophagy related gene, Atg)表達(dá)的Atg蛋白在自噬前體中的位置。Atg8家族的LC3蛋白可以誘導(dǎo)自噬體雙層膜結(jié)構(gòu)的形成，因此LC3一直存在于自噬體的膜結(jié)構(gòu)中，作為自噬體形成的標(biāo)志。哺乳動(dòng)物體內(nèi)的LC3蛋白存在3種不同的亞型(LC3A、LC3B、LC3C)，這3種亞型的LC3蛋白在不同的組織和細(xì)胞內(nèi)分布情況不同，但目前缺少足夠的研究結(jié)果對(duì)其進(jìn)行詳細(xì)的區(qū)分，現(xiàn)階段通常通過(guò)檢測(cè)組織中LC3B蛋白含量代表組織內(nèi)LC3蛋白的表達(dá)量[15]。本研究結(jié)果顯示，在缺血再灌注24 h，自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3B均可與ONOO-共定位，提示NO與腦缺血再灌注過(guò)程中腦組織自噬的激活存在相關(guān)性。

研究[11]表明，在大腦缺血再灌注幾小時(shí)后，自噬相關(guān)蛋白表達(dá)量上升，參與缺血再灌注損傷的多個(gè)病理生理過(guò)程。但是自噬在腦缺血再灌注損傷過(guò)程中所扮演的角色仍存在爭(zhēng)議。當(dāng)自噬適度激活時(shí)[15]，可促使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)細(xì)胞器等垃圾物質(zhì)降解，產(chǎn)生氨基酸、能量等補(bǔ)充細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)不足，對(duì)細(xì)胞存活具有促進(jìn)作用。Ye等[16]的研究表明，自噬的激活對(duì)新生缺氧缺血性腦病大鼠產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。而當(dāng)自噬過(guò)度激活時(shí)，可破壞細(xì)胞內(nèi)部穩(wěn)態(tài)，擾亂細(xì)胞的正常代謝，導(dǎo)致細(xì)胞裂解，引起自噬性細(xì)胞死亡。Feng等[11]的研究結(jié)果顯示，抑制自噬作用對(duì)腦缺血損傷具有保護(hù)作用。但是缺血再灌注后自噬表達(dá)的上調(diào)是否與NO的產(chǎn)生直接相關(guān)，目前的研究仍缺乏明確的證據(jù)。故而在本研究中，于MCAO術(shù)前30 min經(jīng)腹腔注射NOS抑制劑，以減少缺血再灌注后大鼠腦內(nèi)NO的產(chǎn)生。筆者觀察到，作為NOS抑制劑，L-NAME可有效抑制大鼠MCAO模型中由NO介導(dǎo)的蛋白質(zhì)損傷。同時(shí)，L-NAME也明顯降低了MCAO大鼠腦組織中自噬相關(guān)蛋白LC3B和Beclin1的表達(dá)量，但仍高于Sham組。文獻(xiàn)[17]報(bào)道L-NAME可以保護(hù)腦缺血損傷，改善MCAO大鼠的神經(jīng)功能。因此，本研究推測(cè)NO介導(dǎo)的蛋白質(zhì)損傷導(dǎo)致Beclin1和LC3B的表達(dá)應(yīng)激性上調(diào)，且此時(shí)自噬的表達(dá)的上調(diào)可能加重了腦損傷。L-NAME通過(guò)抑制NOS活性，減少NO的產(chǎn)生，直接避免神經(jīng)元的氧化應(yīng)激損傷；同時(shí)，氧化應(yīng)激損傷的減弱也避免了自噬的進(jìn)一步激活，起到了間接的神經(jīng)保護(hù)作用[18]。

了解再灌注介導(dǎo)的氧化應(yīng)激和自噬之間的相互作用，以明確缺血性腦損傷的機(jī)制，對(duì)于基于tPA溶栓治療的腦保護(hù)策略研究具有重要意義，且具有一定的臨床價(jià)值。本研究證明缺血再灌注后NO的產(chǎn)生可上調(diào)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)，抑制NO產(chǎn)生可降低自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)量，產(chǎn)生腦保護(hù)作用。以上研究為進(jìn)一步深入探討氧化應(yīng)激和自噬在腦缺血損傷過(guò)程中的相互作用關(guān)系提供了一定的科學(xué)依據(jù)，但是作為腦損傷過(guò)程中的重要因素，氧化應(yīng)激與自噬錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系仍需要進(jìn)行更深層次的探究。

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