師文娟 趙詠梅 戚智鋒 黃語悠 房亞蘭 劉克建

(首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院 北京市老年病醫(yī)療研究中心 腦血管病轉(zhuǎn)化醫(yī)學北京市重點實驗室，北京100053)

缺血性腦卒中是一種由于腦組織局部區(qū)域血液供應(yīng)障礙，導致腦組織缺血缺氧性病變壞死、進而產(chǎn)生神經(jīng)功能缺失的高發(fā)疾病。缺血再灌注過程中涉及炎性級聯(lián)反應(yīng)，導致神經(jīng)細胞死亡或凋亡，加重缺血性損傷，因此干預(yù)腦缺血后的炎性反應(yīng)是較為有效的治療方案。腦缺血炎性反應(yīng)受到多種基因調(diào)節(jié)，其中核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)作為細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導的樞紐，在炎性反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，成為抗腦缺血炎性損傷的重要靶點[1]。

在神經(jīng)系統(tǒng)中，NF-κB 廣泛分布于神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞和血管內(nèi)皮細胞中，由p65或p50亞基形成二聚體，最常見的NF-κB亞基組成形式為p65/p50或p65/p65[2]。腦缺血再灌注損傷時 NF-κB活化后轉(zhuǎn)位進入細胞核并與特定的DNA序列結(jié)合，誘導啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄及表達，從而激活炎性反應(yīng)因子及細胞因子，導致缺血后炎性級聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生[3]。NF-κB主要受其抑制劑(inhibitor of κB，IκB)蛋白調(diào)節(jié)[4]。白細胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)是一種可由NF-κB介導產(chǎn)生的重要炎性因子，它可通過促使白細胞浸潤和血小板黏附內(nèi)皮細胞以及其他多種途徑造成細胞和組織的損害[5]。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)也是重要的炎性反應(yīng)介質(zhì)，在缺血后受NF-κB調(diào)控可引起神經(jīng)細胞的炎性損傷[6]。

常壓高濃度氧(normobaric hyperoxia, NBO)治療是一種能夠直接改善缺血腦組織氧合狀態(tài)的有效易行的療法，在恢復(fù)腦組織氧分壓方面有顯著功效，這種保護歸因于NBO 具有提高缺血腦組織能量代謝的能力，已經(jīng)證實NBO治療能增加大腦血流量和氧輸送，從而可對腦缺血再灌注損傷涉及的一系列復(fù)雜病理過程予以干預(yù)保護[7]。然而方便易行的NBO能否成為抵抗缺血炎性反應(yīng)的潛在治療方式從而用于腦卒中的救治值得探究，目前尚沒有直接證據(jù)顯示，NBO對NF-κB引發(fā)的缺血后炎性反應(yīng)是否具有調(diào)節(jié)作用，本研究旨在利用大鼠腦缺血再灌注模型，研究NBO治療對腦缺血核心區(qū)IL-1β因子、TNF-α因子、NF-κB蛋白及其抑制蛋白IκB的影響，為缺血性腦卒中治療的干預(yù)策略提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備

小動物麻醉機(Harvard Apparatus公司，美國)、手術(shù)顯微鏡(Carl Zeiss公司，德國)、雙極電凝器(德威公司，中國)、冷凍切片機(Thermo Fisher Scientific公司，美國)、正置熒光顯微鏡(Nikon公司80i，日本)、化學發(fā)光系統(tǒng)(Chemi Scope公司，中國)。

1.2 實驗材料

SPF級雄性SD大鼠15只，體質(zhì)量280～320 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，實驗動物許可證號：SCXK(京)2014-0001。恩氟烷購自河北一品制藥公司；NF-κB p65抗體、IκB抗體、IL-1β抗體、TNF-α抗體購自美國CST公司；OCT冰凍切片包埋劑、GAPDH抗體、HRP標記山羊抗小鼠/ 兔二抗購自北京中杉金橋公司；抗兔熒光二抗購自美國Invitrogen公司等。

1.3 動物模型制作及取材

依據(jù)數(shù)字表法隨機將SD大鼠分為Sham組(n=3)、Normoxia組(n=6)和NBO組(n=6)。稱體質(zhì)量后，先使用5%(體積分數(shù))恩氟烷誘導麻醉大鼠，后使用2%(體積分數(shù))恩氟烷混合70%(體積分數(shù))N2O及30% (體積分數(shù))O2維持麻醉狀態(tài)。按照改良的Longa線栓法[8]制備大鼠大腦中動脈阻塞模型(middle cerebral artery occlusion, MCAO)缺血再灌注模型：于大鼠頸部正中切口，鈍性分離暴露右側(cè)頸總、頸內(nèi)及頸外動脈；電凝頸外動脈后，在頸外動脈殘端剪口，將線栓插入頸內(nèi)動脈，至線栓頂端距離頸總動脈分叉處約1.8～2.0 cm且遇阻力感時停止。術(shù)中監(jiān)測大鼠心率、血壓及肛溫，保持各項生理參數(shù)在正常范圍。阻斷血流90 min后，拔出線栓恢復(fù)血流灌注。Sham組大鼠進行手術(shù)及插栓操作后即刻拔出線栓恢復(fù)血供。NBO組大鼠于缺血5 min后，置于通入100%(體積分數(shù))O2的麻醉盒中，其他兩組大鼠置于空氣環(huán)境。再灌注24 h處死大鼠取腦，于視交叉處作冠狀切片，向前囟方向切2 片，小腦方向切4 片，每片厚度約2 mm。留取第3片腦組織用作Western blotting檢測，第4 片腦組織速凍包埋后用作冰凍切片。依據(jù)文獻[9-10]報道缺血核心區(qū)的病理特征及位置分布，選取缺血側(cè)腦片中線旁開5.5 mm的外側(cè)皮質(zhì)為核心區(qū)范圍。

1.4 Western blotting檢測

選取缺血核心區(qū)腦組織，加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑后置于冰上勻漿，冰浴30 min后于4 ℃，12 000 g離心30 min，BCA法測定上清液蛋白濃度。加入上樣緩沖液，95 ℃水浴10 min，行SDS-PAGE電泳分離，以90 V恒定電壓轉(zhuǎn)膜100 min。5%(質(zhì)量分數(shù))脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別置于對應(yīng)一抗溶液中4 ℃孵育過夜，NF-κB p65抗體(1∶1 000)，IκB抗體(1∶1 000)，GAPDH抗體(1∶1 000)。次日以TBST漂洗印跡膜5 min，重復(fù)3次；加入HRP標記的山羊抗小鼠/兔二抗(1∶6 000)，室溫孵育1 h。吸去二抗，以TBST漂膜5 min，重復(fù)3次；在膜上滴加化學發(fā)光液顯影，使用化學發(fā)光系統(tǒng)掃描分析。蛋白水平用NF-κB p65或IκB與相應(yīng)GAPDH的條帶灰度比值表示。

1.5 免疫熒光檢測

大鼠腦組織經(jīng)OCT包埋后，行厚度為20 μm的冰凍切片。將切片置于預(yù)冷丙酮中固定10 min，PBS洗兩次，加0.3%(體積分數(shù))TritonX-100對切片進行破膜通透10 min，PBS洗兩次，加5%(質(zhì)量分數(shù))BSA室溫封閉1 h后分別滴加對應(yīng)一抗 (NF-κB 1∶200， IL-1β 1∶200，TNF-α 1∶200)，4 ℃ 孵育過夜。 PBS漂洗切片3次，每次5 min；滴加熒光二抗(1∶300)，室溫避光孵育1 h；PBS漂洗3次，每次5 min；用含DAPI染料的防熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 NBO治療抑制大鼠腦缺血核心區(qū)IL-1β的表達

免疫熒光染色結(jié)果顯示，Sham組大鼠大腦組織偶見微弱熒光染色。與Sham組相比，Normoxia組大鼠缺血核心區(qū)IL-1β陽性細胞數(shù)目增多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與Normoxia組相比，NBO組大鼠缺血核心區(qū)IL-1β陽性細胞數(shù)目減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，熒光強度也有所減弱(圖1)。

2.2 NBO治療抑制大鼠腦缺血核心區(qū)TNF-α的表達

免疫熒光染色結(jié)果顯示，Sham組大鼠大腦組織偶見微弱熒光染色。Normoxia組大鼠缺血核心區(qū)TNF-α陽性細胞數(shù)目較Sham組增多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；NBO組大鼠缺血核心區(qū)TNF-α陽性細胞數(shù)目較Normoxia組減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，熒光強度也有所減弱(圖2)。

圖1 免疫熒光檢測大鼠腦缺血核心區(qū)IL-1β表達Fig.1 Immunofluorescence staining of IL-1β in the core ischemic region of rats following cerebral ischemia

圖2 免疫熒光檢測檢測大鼠腦缺血核心區(qū)TNF-α表達Fig.2 Immunofluorescence staining of TNF-α in the core ischemic region of rats following cerebral ischemia

2.3 NBO治療對大鼠腦缺血核心區(qū)NF-κB活化有一定程度的抑制作用

免疫熒光結(jié)果顯示，NF-κB p65被綠色熒光二抗標記，Sham組大鼠腦組織顯示微弱熒光染色。不同實驗組間NF-κB p65發(fā)生入核轉(zhuǎn)移的陽性細胞數(shù)的差異代表其NF-κB活化程度有所不同。與Sham組相比，Normoxia組缺血核心區(qū)NF-κB p65熒光強度明顯增強， NF-κB p65胞核染色陽性的細胞數(shù)量明顯增多；與Normoxia組相比，NBO組缺血核心區(qū)NF-κB p65入核陽性細胞數(shù)目減少、熒光強度減弱，表明NF-κB活性受到一定程度的抑制，詳見圖3。

Western blotting檢測結(jié)果顯示與Sham組相比，實驗組缺血核心區(qū)NF-κB p65濃度均有所升高；與Sham組相比，Normoxia組缺血核心區(qū)NF-κB p65蛋白濃度升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與Normoxia組相比，NBO組缺血核心區(qū)NF-κB p65蛋白濃度降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明NBO對缺血-再灌注大鼠缺血NF-κB的活化有一定程度的抑制作用，詳見圖4A。

2.4 NBO治療抑制大鼠腦缺血核心區(qū)IκB蛋白的降解

Western blotting檢測結(jié)果顯示：與Sham組相比，Normoxia組缺血核心區(qū)IκB蛋白濃度降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與Normoxia組相比，NBO組缺血核心區(qū)IκB蛋白濃度升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；NBO組缺血核心區(qū)IκB蛋白濃度與Sham組差異不明顯，詳見圖4B。

3 討論

研究[11]表明炎性反應(yīng)所致的繼發(fā)性損害是腦缺血損傷的主要原因，由于核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB可以調(diào)節(jié)多種炎性因子轉(zhuǎn)錄及表達，因而被認為是腦缺血后炎性級聯(lián)反應(yīng)的始動因素，參與了腦缺血損傷的發(fā)生及發(fā)展的主要過程，因此在腦缺血病程中對NF-κB進行干預(yù)可能會是較為有效的治療策略。

NF-κB在神經(jīng)元、 神經(jīng)膠質(zhì)細胞和腦血管內(nèi)皮細胞中通常有較低量的表達，它在炎性反應(yīng)因子的轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)起著關(guān)鍵性作用。缺血時NF-κB被激活，活化的NF-κB可促使IL-1β、 TNF-α等炎性因子表達上調(diào)，反之這些因子也可以激活NF-κB，從而使NF-κB的活化在組織間不斷擴散，加重炎性反應(yīng)[12]。研究[13]表明抑制NF-κB活化是減輕腦缺血炎性損傷的重要途徑，由于NF-κB是腦缺血炎性反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)，所以拮抗NF-κB的活化，可能起到有效的抗炎效果，從而發(fā)揮腦保護作用；而IκB的降解是NF-κB活化的重要條件，抑制或減少IκB降解可抑制NF-κB的活化[14]。本研究中NBO組缺血核心區(qū)IκB蛋白濃度較Normoxia組明顯升高，說明NBO治療顯著抑制了缺血核心區(qū)IκB蛋白的降解。

圖3 免疫熒光檢測檢測大鼠腦缺血核心區(qū)NF-κB p65活化水平Fig.3 Immunofluorescence staining of NF-κB p65 in the core ischemic region of rats following cerebral ischemia

然而，NF-κB在腦缺血病程中的作用具有雙面性，一方面活化的NF-κB 通過促進炎性反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展、誘導細胞凋亡、介導自由基損傷等途徑，加重腦缺血損傷[15]；另一方面NF-κB的抑制細胞凋亡機制對于保護缺血性腦損傷具有重要作用[16]。因此適度抑制NF-κB 的活化對治療腦缺血再灌注損傷疾病將會有很大價值，但同時需要關(guān)注的是還要將NF-κB的活性控制在一定的范圍內(nèi)，這將成為腦缺血性損傷疾病干預(yù)的新策略。本研究免疫熒光結(jié)果顯示NBO治療組缺血核心區(qū)NF-κB活化發(fā)生核轉(zhuǎn)位的細胞數(shù)目較Normoxia組明顯減少，但仍多于Sham組，說明NBO治療既可維持NF-κB轉(zhuǎn)錄因子一定程度的激活狀態(tài)，有利于抑制凋亡、啟動機體自身保護機制；又可防止其過度活化，從而抑制炎性因子的表達，免疫熒光檢測顯示NBO治療組缺血核心區(qū)IL-1β及TNF-α表達比Normoxia組顯著減少，說明NBO治療具有抗炎作用進而減輕腦缺血損傷。以上結(jié)果綜合提示NBO治療可能通過適度調(diào)節(jié)缺血核心區(qū)NF-κB的活化程度以發(fā)揮腦保護作用。

腦缺血性損傷根本致病原因是局部腦血管血流不暢導致的缺血缺氧，給予常壓高濃度治療恰是針對性地幫助缺血組織恢復(fù)氧分壓，可以避免引入化學藥物干預(yù)因素，減輕其他附加影響，可能對于一些在腦缺血再灌注損傷中具有雙重作用的關(guān)鍵靶點起到適度調(diào)節(jié)的效果，有助于為腦缺血性損傷疾病干預(yù)方式提供新的思路和策略。

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