李 楊 陳振萍 李 剛 甄英姿 吳心怡 吳潤(rùn)暉

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院血液腫瘤中心，北京 100045)

血友病A(hemophilia A, HA)是由于缺乏FⅧ導(dǎo)致的先天性出血性疾病，最主要的臨床表現(xiàn)為自發(fā)性、難以控制的出血。凝血因子抑制物是在血友病替代治療過程中產(chǎn)生的針對(duì)凝血因子的特異性抗體，是目前血友病治療中最嚴(yán)重的合并癥之一。重型血友病A患者抑制物發(fā)生率高達(dá)20%～30%，兒童是抑制物產(chǎn)生的高危人群；血友病B患者抑制物發(fā)生率<5%[1]。抑制物能特異性的中和外源性輸注的凝血因子，不僅增加了出血的風(fēng)險(xiǎn)，而且使得替代治療效果降低或無效。目前對(duì)于抑制物的產(chǎn)生沒有預(yù)防性耐受治療方法，對(duì)于抑制物陽性患者，尤其是有嚴(yán)重出血的患者，建議盡早開始進(jìn)行免疫誘導(dǎo)耐受治療(immune tolerance induce,ITI)。雖然免疫耐受治療以及免疫抑制劑的治療方案取得了一定的治療成效，但是對(duì)于相關(guān)的免疫機(jī)制仍不清楚。對(duì)于抑制物產(chǎn)生及消除的過程中免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)狀態(tài)的研究十分重要。

FⅧ抑制物的產(chǎn)生主要依賴Th細(xì)胞功能，抗原提呈細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞共同作用[2]。T細(xì)胞上的CTLA-4/CD28是目前發(fā)現(xiàn)的最為重要的協(xié)同刺激分子之一，它們競(jìng)爭(zhēng)性地與抗原提呈細(xì)胞上的B7分子結(jié)合，在調(diào)控和維持機(jī)體免疫狀態(tài)的平衡中發(fā)揮重要作用。CD28分子表達(dá)在T細(xì)胞表面，激活和維持T細(xì)胞功能，CD28結(jié)合B7分子，產(chǎn)生激活T細(xì)胞的第二信號(hào)，刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4)，又稱CD152，表達(dá)在包括調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells, Tregs)以及其他被激活的T細(xì)胞[3]，與CD28分子競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合B7分子，是體內(nèi)重要的免疫負(fù)調(diào)控因子。CTLA-4與B7分子有很強(qiáng)的結(jié)合力，能夠改變正常的T細(xì)胞激活，抑制了適當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活[4]，作為重要的免疫調(diào)控因子，其在自身免疫性疾病、腫瘤及移植免疫中發(fā)揮重要作用。

目前對(duì)于血友病抑制物產(chǎn)生的免疫機(jī)制仍不清楚，導(dǎo)致抑制物的預(yù)防和治療目前均無可靠全面的理論依據(jù)，本研究探討在Th細(xì)胞上CTLA-4/CD28軸的平衡對(duì)血友病A兒童抑制物的作用，為進(jìn)一步探索血友病A兒童FⅧ抑制物產(chǎn)生及消除過程中的免疫機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

收集自2016年12月1日至2018年1月1日于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院血友病專業(yè)門診進(jìn)行治療的血友病A患兒，入組標(biāo)準(zhǔn)為：1)年齡<18歲，男性；2)均已經(jīng)確診為中重型血友病A患兒，F(xiàn)Ⅷ∶C活性≤2%；3)在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院血液腫瘤中心血檢室連續(xù)兩次檢測(cè)血友病FⅧ抑制物為陽性(抑制物滴度≥0.6 BU/mL)或陰性(抑制物滴度<0.6 BU/mL)，抑制物陰性患兒暴露日(exposure day, ED)均超過50 d。排除標(biāo)準(zhǔn)為：1)血友病A患兒，F(xiàn)Ⅷ∶C活性>2%；2)血友病B患兒；3)血友病FⅧ抑制物陰性患兒暴露日小于50天；4)伴有骨關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)病、銀屑病、混合性結(jié)締組織病等自身免疫系統(tǒng)疾病。

本研究?jī)?nèi)容征得入組患兒監(jiān)護(hù)人的知情同意，研究方案獲得首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 FⅧ抑制物檢測(cè)[5-6]

FⅧ抑制物滴度檢測(cè)應(yīng)用改良Nijmegen法。檢測(cè)前經(jīng)過72 h洗脫期，連續(xù)2次檢測(cè)滴度≥0.6 BU/mL定義為抑制物陽性，<0.6 BU/mL定義為抑制物陰性。

1.3 CD28+Th細(xì)胞檢測(cè)

應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)患兒外周血CD28+Th細(xì)胞。外周全血中加入流式抗體：anti-CD3-PerCP (BD公司，美國(guó))、anti-CD4-FITC (BD公司，美國(guó))、anti-CD28-PE (Milteny公司，德國(guó))，室溫避光孵育20 min，紅細(xì)胞裂解液(BD FACS Lysing Solution，美國(guó))溶解紅細(xì)胞10 min，所有樣本設(shè)置對(duì)照管，洗滌后上機(jī)分析。

1.4 CTLA-4+Th細(xì)胞檢測(cè)

應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)患兒外周血CTLA-4+Th細(xì)胞。外周全血分離單個(gè)活細(xì)胞，應(yīng)用植物血凝素(PHA，Sigma Aldrich?, Saint Louis, 美國(guó))10 μg/mL 刺激培養(yǎng)48 h。刺激后細(xì)胞加入流式抗體：anti-CD3-PerCP， anti-CD4-FITC，室溫避光孵育20 min，加入破膜固定工作液[FoxP3 Fixation/Permeabilization concentrate體積∶FoxP3 Fixation/Permeabilization Diluent(4 ℃保存)體積=1∶3]避光孵育1 h，洗滌后加入anti-CTLA-4-PE抗體(BD公司，美國(guó))，避光孵育40 min，所有樣本均設(shè)置對(duì)照管，洗滌后上機(jī)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 入組情況

共計(jì)入組58例患兒，入組患兒均為中重型血友病A(FⅧ∶C活性≤2%)患兒，其中抑制物陽性患兒28例，中位月齡為41(14～158)個(gè)月；中位抑制物滴度為18.10(1.00～100.00)BU/mL；抑制物陰性患兒30例，月齡為72(6～199)個(gè)月，所有抑制物陰性患兒均超過50個(gè)暴露日。

2.2 血友病FⅧ抑制物陽性組與陰性組患兒外周血CTLA-4+Th、CD28+Th細(xì)胞的表達(dá)情況

抑制物陽性組患兒外周血CD28+Th細(xì)胞表達(dá)與陰性組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.065)；血友病FⅧ抑制物陽性組患兒外周血的CTLA-4+Th細(xì)胞表達(dá)百分比低于陰性組患兒(P=0.038)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；血友病FⅧ抑制物陽性組患兒CTLA-4/CD28細(xì)胞表達(dá)百分比比值低于陰性組(P=0.042)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，數(shù)據(jù)在Th細(xì)胞門下記錄統(tǒng)計(jì)，詳見表1、圖1。

表1 抑制物陰性組與陽性組相關(guān)免疫細(xì)胞表達(dá)Tab.1 Immune cells in inhibitor negative and positive group M(P25，P75)

圖1 抑制物陽性組與陰性組相關(guān)免疫細(xì)胞的表達(dá)Fig.1 Immune cells in inhibitor negative and positive group

A:There was no difference in the proportion of CD28+Th cells in peripheral blood between inhibitor positive group (n=28) and inhibitor negative group(n=30);B:There was significant difference in the proportion of CTLA-4+Th cells in peripheral blood between inhibitor positive group (n=28) and inhibitor negative group(n=30);C:There was significant difference in the proportion of CTLA-4/CD28 in peripheral blood between inhibitor positive group (n=28) and inhibitor negative group (n=30)*P<0.01;ns:no significance..

2.3 血友病FⅧ抑制物低滴度組和抑制物高滴度組CTLA-4+Th、CD28+Th細(xì)胞表達(dá)情況

因?yàn)镕Ⅷ抑制物滴度的不同會(huì)導(dǎo)致抑制物消除治療的效果存在差異。將抑制物陽性組分為低滴度組(滴度<40 BU/mL)和高滴度組(滴度≥40 BU/mL)，比較血友病FⅧ抑制物低滴度組和抑制物高滴度組CTLA-4+Th細(xì)胞、CD28+Th細(xì)胞在外周血中的比例情況。

低滴度組患兒抑制物滴度為12.30(1.02～35.20)BU/mL，高滴度組滴度為59.20(43.20～100.00)BU/mL。研究結(jié)果顯示，CD28+Th細(xì)胞及CTLA-4+Th細(xì)胞的表達(dá)百分比和CTLA-4/CD28比值在兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見表2。

表2 相關(guān)免疫細(xì)胞在低滴度和高滴度組的表達(dá)Tab.2 Immune cells in low titer inhibitor and high titer inhibitor group M(P25，P75)

3 討論

血友病A是X性染色體連鎖遺傳的出血性疾病，臨床以自發(fā)性出血為主要臨床表現(xiàn)，主要為男性發(fā)病，女性攜帶，發(fā)病率在活產(chǎn)男嬰中為0.5/10 000[7]。目前最為有效的治療方式為外源性凝血因子制劑的替代治療，根據(jù)患者的疾病類型及出血的輕重程度，補(bǔ)充凝血因子。隨著診斷水平的提高、藥品供應(yīng)的增加以及社會(huì)關(guān)注程度的加強(qiáng)，中國(guó)血友病A兒童從診斷、治療到康復(fù)及護(hù)理等多方面的醫(yī)療水平均得到很大程度的提高，極大的改善了中國(guó)血友病兒童的生活質(zhì)量，顯著降低了中國(guó)血友病A兒童由于關(guān)節(jié)、肌肉出血引起的殘疾，甚至是由于嚴(yán)重、大量出血導(dǎo)致的死亡[8]。

目前，替代治療過程中血友病FⅧ抑制物的產(chǎn)生問題成為目前血友病治療中最大的“攔路虎”之一。無論是內(nèi)外源性凝血因子的替代治療還是基因治療，血友病凝血因子抑制物的產(chǎn)生都是挑戰(zhàn)[1]。在不同研究[9-11]中，血友病凝血因子FⅧ抑制物陽性率為5%～30%，而血友病FⅨ抑制物陽性率遠(yuǎn)低于FⅧ，目前有研究顯示低于3%。兒童是抑制物發(fā)生的高危人群，同樣也是預(yù)防和治療抑制物的重要群體。中國(guó)血友病A兒童的抑制物產(chǎn)生率為20%～30%[12-13]。根據(jù)臨床研究及流行病學(xué)的分析，血友病A抑制物的產(chǎn)生受到多方面因素的共同影響。首先是遺傳因素，抑制物的產(chǎn)生受到種族、家族史、FⅧ基因突變類型和細(xì)胞表面分子的遺傳易感性等影響[10-11,14-16]；同樣，抑制物的形成還受到非遺傳因素的影響，包括治療方案、治療強(qiáng)度、初次治療的年齡、治療使用藥品的類型(重組或血漿源性)，研究[17]表明，強(qiáng)烈的FⅧ暴露，尤其生命早期的嚴(yán)重出血、手術(shù)、腫瘤、免疫、炎性反應(yīng)、感染等事件，也是導(dǎo)致抑制物形成的重要原因。

T細(xì)胞的活化過程為免疫性疾病的治療提供了思路和方法，共刺激通路作為T細(xì)胞活化的重要方式，其通路上的拮抗劑可以誘導(dǎo)抗原特異性耐受，從而防止自身免疫性疾病和器官移植中排異反應(yīng)的發(fā)展[18]。T細(xì)胞的完全激活需要雙重信號(hào)，第一個(gè)信號(hào)抗原呈遞細(xì)胞(antigen presenting cell, APC)上肽-主要組織相容性復(fù)合物與T細(xì)胞受體連接；第二信號(hào)則來源于T細(xì)胞表面與APC表面的共刺激分子的相互作用[19]。目前認(rèn)識(shí)較多的共刺激通路分子包括CD28、CTLA-4、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)等。

CTLA-4和CD28是表達(dá)在CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的同源受體，介導(dǎo)T細(xì)胞活化中的相反功能[20]。CD28作為T細(xì)胞表面主要的輔助受體分子，其在APC上的配體為B7-1(CD80)、B7-2(CD86)。CD28在確定T細(xì)胞活性以及敏感性上發(fā)揮關(guān)鍵作用[19]，CD28對(duì)于控制自身免疫性疾病的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的發(fā)育和體內(nèi)平衡非常重要[21]。而CTLA-4作為重要的負(fù)調(diào)控因子，在自身免疫性疾病和移植排異反應(yīng)中發(fā)揮著顯著的負(fù)調(diào)控作用。CTLA-4多表達(dá)在Foxp3+T細(xì)胞和活化的T細(xì)胞內(nèi)，實(shí)驗(yàn)[20]證實(shí)，敲除CTLA-4基因的小鼠會(huì)發(fā)生自身反應(yīng)性T細(xì)胞釋放導(dǎo)致的致死性自身免疫反應(yīng)。而CTLA-4/CD28在T細(xì)胞表達(dá)的平衡是T細(xì)胞相關(guān)免疫正常的重要因素。

在本研究結(jié)果中，CTLA-4/CD28比值在血友病A抑制物陽性患兒表達(dá)顯著低于抑制物陰性患兒，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明在血友病A抑制物陽性患兒中存在T細(xì)胞免疫功能的異常；然而研究結(jié)果顯示，兩組患兒的CD28+Th細(xì)胞表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明上述平衡軸的差異主要由CTLA-4+Th細(xì)胞表達(dá)的差異引起，比值與外周血CTLA-4+Th細(xì)胞的表達(dá)百分比具有很高的相關(guān)性CTLA-4/CD28軸的失衡與血友病FⅧ抑制物的產(chǎn)生，主要是由于CTLA-4+Th細(xì)胞的表達(dá)不足。CTLA-4主要發(fā)揮免疫負(fù)調(diào)控作用，筆者對(duì)血友病A患兒的研究表明，CTLA-4的表達(dá)不足，導(dǎo)致機(jī)體T細(xì)胞相關(guān)的免疫功能在激活后不能得到有效的負(fù)向調(diào)控，不能及時(shí)有效的壓制激活的T細(xì)胞，在T細(xì)胞的刺激下，誘導(dǎo)FⅧ抑制物的產(chǎn)生。CTLA-4途徑是機(jī)體調(diào)控免疫穩(wěn)態(tài)所必需的途徑，與Treg細(xì)胞的負(fù)調(diào)控作用是近些年對(duì)于免疫負(fù)調(diào)控研究的熱點(diǎn)問題，尤其是在腫瘤的免疫性治療、移植排異反應(yīng)和自身免疫相關(guān)的疾病中[22]。有學(xué)者[23]認(rèn)為，Treg通常是通過CTLA-4發(fā)揮抑制作用，但是CTLA-4也可以在非Treg中發(fā)揮作用， Foxp3和CTLA-4可直接指導(dǎo)獨(dú)立的免疫調(diào)節(jié)途經(jīng)，實(shí)際上在很大程度上重疊，這些想法有望幫助我們更好地了解這些途徑的潛在生物學(xué)和治療意義。

CD28主要表達(dá)在CD4+T和CD8+T細(xì)胞，發(fā)揮激活T細(xì)胞的功能。CTLA-4表達(dá)在激活的T細(xì)胞，主要發(fā)揮免疫抑制作用。CD28與CTLA-4與抗原呈遞細(xì)胞上的CD80和CD86結(jié)合，人類CD28和CTLA-4也可以與ICOS(inducible costimulatory molecale)配體結(jié)合[3]。Wiest等[4]在特異性哮喘的研究中發(fā)現(xiàn)，哮喘嚴(yán)重程度與CD4+CTLA-4+T細(xì)胞的表達(dá)成反比，即CD4+CTLA-4+T細(xì)胞表達(dá)越低，哮喘越嚴(yán)重。CTLA-4沒有起到足夠的負(fù)調(diào)控功能，不能控制導(dǎo)致炎性反應(yīng)。

結(jié)論：CTLA-4/CD28軸在維持機(jī)體免疫穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用。在血友病FⅧ抑制物陽性患兒，CTLA-4/CD28軸的平衡情況與陰性組存在差異，其細(xì)胞表達(dá)比值顯著低于抑制物陰性組，并且主要是由于CTLA-4+Th細(xì)胞的低表達(dá)引起。研究結(jié)果表明，CTLA-4可能是血友病FⅧ抑制物產(chǎn)生的免疫影響因素之一。

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