仇云云，崔 健，劉 雪，蔣亞蓉，張 艷，袁 濤

（1.北京林業(yè)大學(xué) 園林學(xué)院 國家花卉工程技術(shù)研究中心，花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實(shí)驗(yàn)室，北京100083；2.江蘇省昆山市住房和城鄉(xiāng)建設(shè)局，江蘇 昆山215300;3.中國林業(yè)科學(xué)研究院 中林東珠景觀設(shè)計(jì)研究院，北京100083）

紫斑牡丹Paeonia rockii為芍藥科Paeoniaceae芍藥屬Paeonia牡丹組Sect.Moutan小灌木［1］，是野生牡丹受威脅程度最高的種類之一，被列為國家三級保護(hù)植物［2］。其種子需沙藏催根，生根后種子的上胚軸仍處于休眠，如休眠不解除，則種子成苗率極低，這是導(dǎo)致野生紫斑牡丹瀕危的重要原因［3］。KENTZER［4］和AMEN［5］認(rèn)為， 抑制物質(zhì)的存在是植物種子休眠的主要原因之一。 周理平等［6］發(fā)現(xiàn)， 紫斑牡丹的種皮、胚乳中含有抑制油菜Brassica campestris種子萌發(fā)及幼苗生長的物質(zhì)，認(rèn)為種子內(nèi)的抑制物質(zhì)是紫斑牡丹種子休眠的重要原因。周仁超等［7］通過紫斑牡丹種皮和胚乳水提液對白菜Brassica pekinensis種子生長影響的研究，認(rèn)為其內(nèi)的抑制物質(zhì)不是種子萌發(fā)的決定因素。上述研究僅測定未生根種子中的抑制物質(zhì)，并未動態(tài)觀察生根及發(fā)芽的種子，因此，單純靠生根前種子各部位浸提液得出種子中抑制物質(zhì)是否為制約紫斑牡丹種子萌發(fā)的結(jié)論值得商榷。本研究選用與紫斑牡丹種子結(jié)構(gòu)類似，具明顯上下胚軸、同時又可迅速生根、發(fā)芽的豌豆Pisum sativum種子為材料，觀察紫斑牡丹種子生根及發(fā)芽前后的種皮、胚、胚乳浸提液對豌豆種子萌發(fā)的影響，測試紫斑牡丹各提取物的抑制強(qiáng)度，并結(jié)合種皮透性及種子離體培養(yǎng)探究紫斑牡丹種子休眠原因，為紫斑牡丹的繁育和保護(hù)提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料

紫斑牡丹種子于2015年9月采集于甘肅省臨洮縣新添鎮(zhèn)上街村，濕沙中變溫層積（20℃暖溫層積90 d生根，4℃低溫層積40 d催芽，20℃暖溫層積60 d發(fā)芽）備用。豌豆種子為市售。

1.2 方法

1.2.1 種皮透水性和透氣性測定 隨機(jī)取飽滿無損傷種子60粒，分完整種子組和去皮種子組，30?！そM－1。稱量后分別放入20℃的恒溫水中，使種子吸水膨脹。隔6 h稱量1次，直至種子恒量。分別計(jì)算每組種子不同階段的吸水率。3次重復(fù)，取平均值。每次各組稱量后均用小籃子法［8］測定種子呼吸速率，分別計(jì)算完整種子與去皮種子的呼吸速率。3次重復(fù)，取平均值。

1.2.2 種子萌發(fā)抑制物質(zhì)活性測定 取生根前、生根后及發(fā)芽后3類種子，分離其種皮、胚乳、胚。80℃下烘干至恒量后粉碎。稱取粉碎品10 g，分別加入蒸餾水定容至100 mL（新鮮種子胚較小，取5 g，定容至50 mL），保鮮膜封口后于20℃浸提24 h，5 000 r·min－1離心 10 min，取上清液即得比例為100%的浸提液，4℃保存。將均勻、飽滿的豌豆種子置于蒸餾水及上述浸提液中，于25℃下培養(yǎng)，保持蒸餾水及浸提液浸潤種子的2/3。72 h后統(tǒng)計(jì)豌豆生根率和根長，144 h后統(tǒng)計(jì)豌豆上胚軸萌發(fā)率和上胚軸長。豌豆種子為30粒·處理－1，3次重復(fù)，取平均值。

1.2.3 種胚離體培養(yǎng) 將流水沖洗后的紫斑牡丹種子用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇消毒30 s，蒸餾水沖洗1次，再用體積分?jǐn)?shù)為0.4%的次氯酸鈉消毒5 min，無菌水沖洗5次。將完整種子（處理1），種皮置于一旁的去皮種子（處理2），去皮種子（處理3），完整裸胚（處理4），去子葉裸胚（處理5）等5個處理接種到MS培養(yǎng)基上，（20±1）℃下培養(yǎng)，定期觀察生根率及生長情況。30?！ぬ幚恚?，3次重復(fù)，取平均值。取處理4和處理5中根長大于3 cm的胚，分2組：一組置于（4±1）℃中，30 d后放回（20±1）℃下繼續(xù)培養(yǎng)；另一組始終放置在（20±1）℃下，30 d后觀察2組發(fā)芽情況。30?！ぬ幚恚?，3次重復(fù)，取平均值。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 用Excel和SPSS 10.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析和最小顯著差異（LSD）法比較差異分析，顯著水平P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 種皮對種子吸水率和呼吸速率的影響

2.1.1 種皮對種子吸水率的影響 由圖1可見：去皮種子吸水率在前18 h內(nèi)增長非?？欤?4 h時，吸水率已接近飽和，此后一直維持在54%左右；完整種子吸水率增長較慢，浸種24 h時僅約28%，72 h后才近飽和?？梢?，種皮在浸種前72 h內(nèi)對種子吸水率的影響較大。

2.1.2 種皮對種子呼吸速率的影響 從圖2可以看出：浸水前完整種子與去皮種子的呼吸速率均很低，去皮種子的呼吸速率在浸種24 h內(nèi)迅速增大，到24 h時達(dá)最大值，約24 μmol·g－1·s－1，72 h后，其呼吸速率又迅速下降，解剖發(fā)現(xiàn)其種胚變黃軟化；完整種子的呼吸速率增長速度慢，浸種72 h后才達(dá)最大值，約19 μmol·g－1·s－1，此后保持不變。完整種子所能達(dá)到的最大呼吸速率值明顯低于去皮種子?？梢姡N皮阻礙了種子的呼吸。

圖1 紫斑牡丹種子吸水率變化Figure 1 Change in water absorption of Paeonia rockii seeds

圖2 紫斑牡丹種子呼吸速率變化Figure 2 Chang in respiration intensity of Paeonia rockii seeds

2.2 不同浸提液對豌豆種子萌發(fā)的影響

2.2.1 不同浸提液中豌豆種子生根率及根長 從圖3和圖4可見：在生根前紫斑牡丹種子胚乳、胚、種皮浸提液中豌豆的生根率、根長依次升高，但都小于對照，說明紫斑牡丹種子胚乳、胚、種皮都會抑制豌豆生根及根生長，但抑制物質(zhì)強(qiáng)度依次降低。在生根后紫斑牡丹種子的胚乳、種皮浸提液中豌豆的生根率及根長均顯著大于在生根前紫斑牡丹種子浸提液中的，而在發(fā)芽后的紫斑牡丹種子的胚乳、種皮浸提液中豌豆的生根率、根長雖有所增加，但與生根后紫斑牡丹種子浸提液中的并無顯著差異。說明紫斑牡丹種子胚乳和種皮中抑制物質(zhì)對豌豆生根抑制強(qiáng)度隨生根進(jìn)程而降低，但生根后到發(fā)芽過程中對豌豆生根的抑制強(qiáng)度并無顯著變化。與胚乳、種皮不同，在生根前、生根后及發(fā)芽后紫斑牡丹種子胚浸提液中豌豆的生根率依次降低，根長無明顯變化。

圖3 豌豆在不同浸提液中的生根率Figure 3 Rating rate of peas in different extracts

圖4 豌豆在不同浸提液中的根長Figure 4 Root length of peas in different extracts

2.2.2 不同浸提液中豌豆種子上胚軸萌發(fā)率及上胚軸長 由圖5和圖6可知：在生根前紫斑牡丹種子種皮、胚、胚乳浸提液中豌豆的上胚軸萌發(fā)率均為0，而對照可達(dá)87.78%，可見生根前紫斑牡丹種子種皮、胚、胚乳完全抑制了豌豆上胚軸的生長；在生根后和發(fā)芽后的的紫斑牡丹種子種皮及胚乳浸提液中的豌豆均有部分上胚軸萌發(fā)，且兩者無顯著差異，說明生根后的紫斑牡丹種子種皮及胚乳浸提液的抑制物質(zhì)已經(jīng)降低到可以使豌豆上胚軸萌發(fā)的強(qiáng)度，且生根后到發(fā)芽過程中紫斑牡丹種子種皮及胚乳浸提液對豌豆上胚軸生長具有抑制作用的物質(zhì)不再發(fā)生顯著變化。在生根前、生根后及發(fā)芽后的紫斑牡丹種子胚浸提液中豌豆的發(fā)芽率均為0。

圖5 豌豆在不同浸提液中的上胚軸萌發(fā)率Figure 5 Epicotyl germination rate of pea in different extracts

圖6 豌豆在不同浸提液中的上胚軸長Figure 6 Epicotyl length of pea in different extracts

2.3 種胚離體培養(yǎng)結(jié)果

從圖7和圖8可見：處理1在60 d內(nèi)紫斑牡丹種子無生根，首粒生根時間明顯晚于其他處理；處理2可以消除種皮的機(jī)械障礙及透水、透氣性影響，保留種皮中可以影響胚生長的物質(zhì)，與處理1相比，紫斑牡丹種子生根快，但60 d內(nèi)僅6%的種子生根；而處理3比處理2早生根約14 d，60 d時生根率約38%，說明去除種皮有利于紫斑牡丹種子生根而種皮中確實(shí)有抑制下胚軸萌發(fā)的物質(zhì)；與處理3相比，處理4和處理5提早約26 d生根，兩者接種12 d后，下胚軸即開始伸長、生根，60 d時生根率約90%，在5個處理中生根最快，生根率最高，且兩者無顯著差異，可見子葉對胚的生根并無影響。胚乳也會影響胚根生長，裸胚（處理4和處理5）較有胚乳的胚（處理3）生根更快更好，去除種皮及胚乳可以促進(jìn)下胚軸快速伸長，使其迅速生根。

圖7 不同處理紫斑牡丹種子的首粒生根時間Figure 7 First rooting time of Paeonia rockii different treatments

圖8 不同處理紫斑牡丹種子60 d內(nèi)的生根率Figure 8 Rooting rate of Paeonia rockii different treatments

從表1可見：未經(jīng)4℃低溫處理的生根胚及生根去子葉胚的上胚軸萌發(fā)率均為0，而低溫處理后兩者的上胚軸萌發(fā)率均達(dá)73%以上，上胚軸長達(dá)2.7 cm，且兩者無顯著差異。可見僅去除子葉而不經(jīng)過低溫不能打破紫斑牡丹種子上胚軸休眠。這與JING等［9］的研究結(jié)果不同，他認(rèn)為子葉是控制牡丹Paeonia種子上胚軸休眠的關(guān)鍵部位，而周仁超等［7］研究表明，子葉對上胚軸休眠無影響，這與本試驗(yàn)結(jié)論類似。

表1 不同處理紫斑牡丹種胚的上胚軸萌發(fā)率及上胚軸長Table 1 Epicotyl germination rate and length of Paeonia rockii embryo in different treatments

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

種皮透性研究表明：種皮對紫斑牡丹種子的吸水率及呼吸速率有一定影響，去除種皮能提高其吸水速率和呼吸速率，加快吸水進(jìn)程。

豌豆種子萌發(fā)研究表明：紫斑牡丹種子的種皮、胚、胚乳均含有抑制物質(zhì)，其中，種皮的抑制物質(zhì)強(qiáng)度最弱，胚乳的抑制物質(zhì)強(qiáng)度最強(qiáng)，這與鳳丹牡丹Paeonia ostii［10］，四川牡丹P.decomposita［11］類似，而與大花黃牡丹P.ludlowii不同，其種皮的抑制物質(zhì)最強(qiáng)，而胚乳的抑制物質(zhì)較弱［12］；種皮及胚乳對豌豆生根及上胚軸生長的抑制強(qiáng)度在生根過程中均明顯下降，生根后到發(fā)芽過程中并無明顯變化，且在生根種子種皮及胚乳浸提液中的豌豆上胚軸均有大量萌發(fā)率。因此認(rèn)為，紫斑牡丹種子生根與種皮及胚乳中抑制物質(zhì)強(qiáng)度下降有關(guān)，而其上胚軸的萌發(fā)與生根后到發(fā)芽過程中種皮及胚乳中抑制物質(zhì)強(qiáng)度的變化無明顯關(guān)系。

本研究進(jìn)行了不同處理的胚培養(yǎng)試驗(yàn)，結(jié)合豌豆萌發(fā)試驗(yàn)的生物測定方法初步揭示了紫斑牡丹種子休眠的原因。結(jié)論如下：種子下胚軸休眠的原因包括種皮的機(jī)械障礙和透性，種皮和胚乳的抑制物質(zhì)，去除種皮及胚乳可以解除下胚軸休眠，促進(jìn)生根；種子上胚軸休眠的原因與生根種子種皮及胚乳的抑制物質(zhì)無關(guān)，去除種皮、胚乳及子葉無法解除其休眠，必須經(jīng)過低溫處理方可解除上胚軸休眠。

3.2 討論

種子萌發(fā)抑制物質(zhì)的測定方法有很多，常見的方法如高效液相色譜法（HPLC），氣相色譜法（GS）和酶聯(lián)免疫吸附檢測法(EIISA）等［13］。這些方法可以將抑制物質(zhì)具體分類到不同激素種類進(jìn)行測定，但操作較為復(fù)雜，且需要一定的試劑、儀器等支持。而傳統(tǒng)的生物測定法雖不能將抑制物質(zhì)具體分類到特定激素進(jìn)行測定，卻可以簡單易行地測定出抑制物質(zhì)的強(qiáng)弱。在以往的生物測定試驗(yàn)中，人們多數(shù)采用白菜Brassica pekinensis籽作為萌發(fā)試驗(yàn)材料，如白花延齡草Trillium kamtschaticum種子的甲醇和水浸提液對白菜籽幼根的生長均有明顯的抑制作用，而乙酸乙酯浸提液對白菜籽生長無顯著影響，說明其種子中的抑制物質(zhì)是極性化合物［14］；烏桕Sapium sebiferum種子種皮或胚乳浸提液明顯抑制白菜籽的生長，且胚乳浸提液的抑制性強(qiáng)于種皮的［15］。 其他， 如麻櫟 Quercus acutissima［16］， 紅豆杉 Taxus chinensis［17］，茖蔥 Allium victorialis［18］， 青錢柳 Cyclocarya paliurus［19］， 紫椴 Tilia amurensis［20］等種子休眠的研究中均有人采用白菜籽作為萌發(fā)試驗(yàn)材料來探究其抑制物質(zhì)的強(qiáng)弱。也有部分人采用油菜Brassica campestris籽作為萌發(fā)材料，如田勝尼等［21］利用油菜種子萌發(fā)法測定了南方紅豆杉Taxus mairei種皮及胚乳中的抑制物質(zhì)強(qiáng)弱，而楊勇等［22］、周理平等［6］用油菜種子萌發(fā)法分別測定了四川牡丹、紫斑牡丹種子中的抑制物質(zhì)。另有少數(shù)人采用小麥Triticum aestivum作為萌發(fā)材料進(jìn)行抑制物質(zhì)的生物測定。如SONG等［23］對四川牡丹的研究表明，其種皮及胚乳中均含有強(qiáng)烈抑制小麥種子生長的物質(zhì)，且胚乳具有更強(qiáng)的抑制性。上述研究中的白菜、油菜、小麥種子的胚無明顯上胚軸分化，測定抑制物質(zhì)時僅可以觀察其生根情況而無法觀察其上胚軸的生長。牡丹種子有明顯的上下胚軸之分，具有雙胚軸休眠特性，且以上胚軸休眠更為突出［24］。因此，本試驗(yàn)采用與牡丹種子胚結(jié)構(gòu)相似、具有明顯上、下胚軸之分的豌豆種子代替?zhèn)鹘y(tǒng)的萌發(fā)試驗(yàn)材料，可以更清楚分析浸提液對豌豆種子上、下胚軸生長的影響。

種子休眠與萌發(fā)是一個十分復(fù)雜的過程。大量研究表明：在休眠種子中通常存在發(fā)芽抑制物質(zhì)，且該類物質(zhì)可以通過水或有機(jī)溶劑萃取出來，主要包括激素、萜類、香豆素類化合物和脂肪酸等［25－29］。激素在種子的休眠與萌發(fā)中具有十分重要的作用。赤霉素（GA）和脫落酸（ABA）是植物種子萌發(fā)調(diào)控中的2類重要植物激素，兩者具有拮抗作用，相互協(xié)同調(diào)節(jié)種子的休眠與萌發(fā)［30－31］。GA可以增強(qiáng)內(nèi)源水解酶活性，削弱種皮及胚乳等的機(jī)械障礙，并能夠促進(jìn)儲藏物質(zhì)的分解，促進(jìn)胚胎的生長，與種子休眠的解除有關(guān)［32］。ABA促進(jìn)并維持休眠，抑制種子的萌發(fā)，ABA生物合成酶相關(guān)基因的表達(dá)可以導(dǎo)致休眠加重［33－35］。芍藥Paeonia lactiflora胚培養(yǎng)的研究中發(fā)現(xiàn)，在瓊脂糖凝膠中加入GA可以打破胚的上胚軸休眠，若再往培養(yǎng)基中加入100 mol·L－1的ABA，則GA促進(jìn)上胚軸休眠的作用就會完全被抑制［36］，有研究表明，ABA可以抑制GA誘α淀粉酶活性［37］，同時能抑制β-1,3-葡聚糖酶的表達(dá)，影響胚乳中營養(yǎng)物質(zhì)的代謝，延緩種子的萌發(fā)［38］。此外，細(xì)胞分裂素（CTK），乙烯（ETH），油菜素內(nèi)酯（BR）等也是常見的與種子休眠萌發(fā)相關(guān)的激素，如ETH對擬南芥Arabidopsis thaliana，豌豆，煙草Nicotiana tabacum等許多植物種子的萌發(fā)十分重要［39－40］。除常見的各類激素外，還存在一些其他對植物種子休眠萌發(fā)有影響的化合物。如種子中的多酚、單寧酸、酚類物質(zhì)可以通過抑制部分代謝途徑而影響櫟類種子的萌發(fā)［41－42］。

本研究發(fā)現(xiàn)：豌豆在生根后及發(fā)芽后的紫斑牡丹種胚浸提液中的生根率、發(fā)芽率及根長、芽長均小于在未生根紫斑牡丹種胚浸提液中的。這可能是生根及發(fā)芽的紫斑牡丹種子的根及莖葉釋放出了新的化感物質(zhì)，從而對豌豆產(chǎn)生了異株克生的作用［43］。有研究表明：牡丹具有自毒效應(yīng)［44－45］，且牡丹根和葉的浸提物對多種植物的生長具有抑制作用［46－47］。本研究未能準(zhǔn)確地測定種子萌發(fā)抑制物質(zhì)種類，不能明確紫斑牡丹種子上胚軸休眠是胚內(nèi)部抑制物質(zhì)還是胚內(nèi)其他原因。建議在以后的研究中分析種子各部分，尤其是胚內(nèi)抑制物質(zhì)的具體成分，并嘗試分離化感類抑制物質(zhì)。

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