茍東東

（楊凌金海生物技術(shù)有限公司，陜西 咸陽(yáng) 712100）

細(xì)胞污染是指細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，由于操作不慎或滅菌不徹底將細(xì)菌、霉菌或其他異物等帶入細(xì)胞培養(yǎng)物中，對(duì)細(xì)胞的生存環(huán)境造成侵害的現(xiàn)象。20世紀(jì)自Moran和Schenerman等人發(fā)現(xiàn)，懸浮培養(yǎng)的規(guī)模可以從3 L放大到10 000 L，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的規(guī)模開始擴(kuò)大，廣泛地應(yīng)用于抗體的制備或病毒疫苗的生產(chǎn)，但由于細(xì)胞培養(yǎng)自身有其環(huán)境敏感性和培養(yǎng)條件苛刻性等特性，如果受到外源性污染，將對(duì)生物制品研究或制品生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重的危害。為了防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中受到其他污染因素的影響，有必要了解細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中污染來(lái)源、染菌種類等，建立起規(guī)范化的操作及防治策略，盡可能地保證細(xì)胞培養(yǎng)工序的穩(wěn)定性及生產(chǎn)可靠性是有必要的。

1 造成污染的來(lái)源

1.1 操作人員

人是細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中重要的污染源。據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，人自然活動(dòng)時(shí)，人體散發(fā)出的熱量形成一股熱流，這股熱流便于微小粒子（大于0.3μm）的擴(kuò)散，漫步時(shí)每分鐘產(chǎn)生5.0×106個(gè)，快步時(shí)產(chǎn)生1.0×107個(gè)。人體的各部位都生長(zhǎng)著各類微生物，由此可見人體也會(huì)給微生物的生長(zhǎng)繁殖創(chuàng)造一個(gè)良好的環(huán)境，因此，加強(qiáng)無(wú)菌意識(shí)顯得尤為重要。從事細(xì)胞培養(yǎng)工作人員一定要注意個(gè)人衛(wèi)生習(xí)慣，要經(jīng)常洗澡、洗頭、剪指甲，不得化妝、佩戴飾物和手表，工作時(shí)要帶上消毒好的口罩，以免因交談、咳嗽等導(dǎo)致傳播范圍擴(kuò)大，且不定時(shí)對(duì)手部等風(fēng)險(xiǎn)較高的位置進(jìn)行消毒。

1.2 培養(yǎng)環(huán)境

按照GMP廠房設(shè)施及《潔凈廠房設(shè)計(jì)規(guī)范》（GB 50073—2013）中對(duì)潔凈區(qū)內(nèi)換氣次數(shù)的要求為15～25 h-1，其目的是為將潔凈室污染粒子消除，空調(diào)系統(tǒng)須送風(fēng)于潔凈室中循環(huán)，對(duì)室內(nèi)污染粒子進(jìn)行稀釋，以保持潔凈室潔凈度處于可控范圍，且HVAC驗(yàn)證合格后方可投入使用，按要求每年需進(jìn)行檢漏試驗(yàn)，并且每月進(jìn)行一次大環(huán)境沉降菌檢測(cè)來(lái)確保環(huán)境符合要求。

隨著國(guó)內(nèi)細(xì)胞工藝的改革，傳統(tǒng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶工藝已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)跟不上醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的需求，在以往的無(wú)菌操作中，所有敞口操作都必須在酒精燈火焰旁，現(xiàn)如今采用細(xì)胞密閉培養(yǎng)系統(tǒng)（生物反應(yīng)器），除非是取樣口等外部關(guān)鍵部位需要火焰對(duì)其進(jìn)行外部消毒，但是為了排除后續(xù)細(xì)胞污染因環(huán)境因素所帶來(lái)的干擾，有必要按規(guī)定定期對(duì)環(huán)境進(jìn)行消毒及環(huán)境質(zhì)量檢測(cè)，并對(duì)區(qū)域內(nèi)房間壓差進(jìn)行監(jiān)控，防止低級(jí)別房間的不潔凈空氣倒流。

按照獸藥GMP現(xiàn)行版的要求，在人、物流通道要加強(qiáng)管理。比如，所有進(jìn)入潔凈區(qū)的物品必須在進(jìn)入潔凈區(qū)之前脫去外包，并用消毒液對(duì)其表面進(jìn)行擦拭消毒。防止包裝上的灰塵進(jìn)入潔凈區(qū)，污染環(huán)境。筆者以前遇到過(guò)有員工在值班期間為了省事，不按照潔凈區(qū)更衣規(guī)程直接進(jìn)入潔凈區(qū)域，因此，加強(qiáng)員工潔凈區(qū)管理意識(shí)等方面培訓(xùn)顯得尤為重要。

1.3 設(shè)備器具

在筆者以前從事細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的過(guò)程中，潔凈室空氣潔凈度為局部環(huán)境百級(jí)，首先用75%酒精對(duì)進(jìn)入百級(jí)環(huán)境中使用的物品進(jìn)行表面消毒，并對(duì)層流下的操作臺(tái)進(jìn)行擦拭處理，打開紫外燈進(jìn)行照射15 min，然后打開風(fēng)機(jī)進(jìn)行自凈。使用中的轉(zhuǎn)瓶、除菌濾器、膠塞等工具必須經(jīng)過(guò)121℃、60 min濕熱滅菌處理。之后，筆者從事了細(xì)胞規(guī)模化培養(yǎng)工作，對(duì)生物反應(yīng)器有了新的認(rèn)識(shí)，所謂“死角”，即SIP過(guò)程中蒸汽的高溫所達(dá)不到、消不透的角落。死角在生物反應(yīng)器容易形成的部位有擋板的背后、罐內(nèi)管路浸漬管內(nèi)殘留的焦化物，罐體腰部培養(yǎng)基進(jìn)料口、罐體取樣系統(tǒng)、溫度計(jì)、PH、DO等部位夾縫之間的殘留焦化物。以上的這些死角，在分批次規(guī)模化培養(yǎng)過(guò)程中，由于個(gè)別罐體培養(yǎng)周期過(guò)長(zhǎng)，期間要進(jìn)行取樣、計(jì)數(shù)、染色及培養(yǎng)基補(bǔ)料操作，操作結(jié)束后要及時(shí)清洗。如果清洗不徹底，則容易形成死角，這些死角中含有細(xì)胞培養(yǎng)懸液，經(jīng)過(guò)高溫容易形成越來(lái)越多、堅(jiān)硬的焦化層，這些焦化層是藏污納垢、雜菌避免高溫殺滅的絕好保護(hù)層。所以，罐體培養(yǎng)結(jié)束后，下罐檢查并清除罐內(nèi)的死角和殘?jiān)?，是人為消滅雜菌的重要措施。具體流程如圖1所示。

圖1 具體工作流程

2 污染的種類

2.1 細(xì)菌污染

由于體外培養(yǎng)的細(xì)胞自身沒(méi)有抵抗污染的能力，污染較常見的有大腸桿菌、白色葡萄球菌、假單孢菌等。加用抗生素的培養(yǎng)液可預(yù)防和排除少量細(xì)菌的污染。一旦發(fā)生細(xì)菌污染，則很容易發(fā)現(xiàn)，多數(shù)情況下培養(yǎng)液短時(shí)間內(nèi)變黃，表明有大量酸性物質(zhì)產(chǎn)生，并出現(xiàn)明顯渾濁現(xiàn)象；有時(shí)靜置的培養(yǎng)液起初不混，但稍加震蕩，就有許多渾濁物漂起。倒置顯微鏡下觀察，可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒物漂浮，有時(shí)在細(xì)胞表面及周圍有大量細(xì)菌存在。有的培養(yǎng)液改變不明顯而又疑似污染，也可按照現(xiàn)行版《中國(guó)獸藥典》中關(guān)于無(wú)菌檢測(cè)等方法判斷。在規(guī)?；a(chǎn)過(guò)程中，用革蘭氏染色方法可以快速辨別染菌情況，如圖2所示。

圖2 用革蘭氏染色方法快速辨別染菌

2.2 真菌污染

真菌的種類很多，污染的多是曲霉菌、白色念珠菌、酵母菌、黑霉菌、孢子菌等。真菌污染后多數(shù)在培養(yǎng)液中形成淡黃色或是白色的漂浮物，一般肉眼可見，較易被發(fā)現(xiàn)，但培養(yǎng)液仍是清亮的，倒置顯微鏡下無(wú)雜質(zhì)，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)兩三天仍清亮，但出現(xiàn)絮狀雜質(zhì)，鏡下可見呈細(xì)絲狀的團(tuán)狀漂浮物，可看到明顯的菌絲，細(xì)胞仍可生長(zhǎng)，但時(shí)間長(zhǎng)之后，細(xì)胞的活力狀態(tài)變差，短期內(nèi)培養(yǎng)液多不變渾濁。倒置顯微鏡下可以看見細(xì)胞之間有縱橫交錯(cuò)穿行的絲狀，樹枝狀或管狀菌絲，并漂浮在培養(yǎng)液中。很多菌絲在高倍鏡下可以看見鏈狀排列的菌株。念珠菌及酵母菌菌株呈卵圓形，散在細(xì)胞上及細(xì)胞周邊生長(zhǎng)。

2.3 支原體污染

支原體是一種大小介于細(xì)菌和病毒之間（最小直徑0.2μm）并獨(dú)立生活的微生物，約有1%可通過(guò)除菌濾器。支原體無(wú)細(xì)胞壁形態(tài)呈高度多形性，并且國(guó)內(nèi)血清很多都沒(méi)有做支原體陰性檢測(cè)，而支原體是牛血清中最常見的微生物之一。支原體多吸附或散在于細(xì)胞表面和細(xì)胞之間。當(dāng)細(xì)胞（特別是傳代細(xì)胞）被支原體污染后，培養(yǎng)液一般會(huì)渾濁，細(xì)胞內(nèi)的DNA、RNA及蛋白表達(dá)發(fā)生改變，而細(xì)胞的生長(zhǎng)率一般并未發(fā)生顯著的影響，因而細(xì)胞被支原體污染一般難以察覺(jué)。

3 細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的異?，F(xiàn)象

3.1 DO異常變化

引起DO異常下降的原因有以下幾個(gè)：①罐體染菌，導(dǎo)致細(xì)菌消耗大量溶氧，致使罐體溶氧監(jiān)測(cè)值在短時(shí)間內(nèi)迅速下降；②細(xì)胞培養(yǎng)接種時(shí)初始密度超出規(guī)定值，氧需求量增加，使溶氧下降；③生物反應(yīng)器培養(yǎng)體積較大時(shí)，如果攪拌轉(zhuǎn)速較慢、停止或者悶罐 （關(guān)閉排氣閥）等，都有可能使溶氧下降。

引起DO異常上升的原因有污染烈性噬菌體、補(bǔ)料時(shí)間或間隔不當(dāng)。綜上所述，根據(jù)培養(yǎng)系統(tǒng)中溶解氧濃度的變化來(lái)判斷細(xì)胞代謝是否正常，有助于查找細(xì)胞培養(yǎng)異常的原因。

3.2 p H異常變化

大多數(shù)細(xì)胞適于pH7.2～pH7.4條件下生長(zhǎng)，筆者所培養(yǎng)的BHK-21細(xì)胞pH要求為pH6.9～pH7.1范圍內(nèi)。當(dāng)罐體細(xì)胞染菌時(shí)，由于細(xì)菌消耗大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)生過(guò)量酸，pH補(bǔ)償系統(tǒng)崩潰，導(dǎo)致罐體pH值全線下降。即使在不確定染菌情況下，所采取的補(bǔ)救措施也于事無(wú)補(bǔ)。

3.3 其他變化

可以根據(jù)其他現(xiàn)象，比如細(xì)胞形態(tài)異常、罐體尾氣氣味、培養(yǎng)過(guò)程中泡沫異常增多、細(xì)胞懸液顏色異常變化等來(lái)判斷，不確定時(shí)也可通過(guò)罐體取樣進(jìn)行革蘭氏染色來(lái)判斷。

4 污染的防治策略

4.1 對(duì)蒸汽質(zhì)量要求

實(shí)踐已證明飽和蒸汽在滅菌過(guò)程中具有潛熱大、穿透力強(qiáng)等特點(diǎn)，所以，反應(yīng)器在SIP過(guò)程中選用飽和蒸汽，罐體滅菌前應(yīng)先將純蒸汽管道中的冷凝水排掉，在線對(duì)空氣濾器滅菌時(shí)應(yīng)注意蒸汽壓力，廠家建議壓力范圍內(nèi)不可以大幅度的波動(dòng)，避免對(duì)濾芯使用壽命產(chǎn)生影響。按照各企業(yè)要求定期對(duì)不凝性氣體、過(guò)熱值、干燥值等檢測(cè)，確保將所需蒸汽符合相關(guān)要求。

4.2 對(duì)設(shè)備的要求

生物反應(yīng)器及其附屬設(shè)備在管道對(duì)接過(guò)程中應(yīng)注意墊圈大小是否匹配、法蘭是否平整、安裝是否對(duì)中、法蘭與管道的焊接是否有砂眼。全盤或半盤管應(yīng)定期檢漏。過(guò)濾器在滅菌柜中滅菌時(shí)要注意冷凝水的排放且罐體進(jìn)料所使用濾芯的大小筆者建議使用20in，罐體取樣裝置，建議使用原廠，包括GMP閥組（符合ASME-BPE要求）。

4.3 對(duì)工藝操作的要求

細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，用CIP對(duì)罐體及附屬設(shè)備進(jìn)行預(yù)沖洗，操作人員進(jìn)入罐體對(duì)罐內(nèi)、附屬設(shè)備死角、傳感器安裝處及攪拌槳背面、罐頂?shù)炔课贿M(jìn)行殘?jiān)宄乐菇够瘜赢a(chǎn)生，并對(duì)空罐進(jìn)行SIP滅菌后保存。培養(yǎng)基配制罐及培養(yǎng)基傳送管道使用后要及時(shí)清洗并滅菌，這樣既可以降低生物載荷，又可以起到控制制品熱源的作用。生物反應(yīng)器及其附屬管道在SIP過(guò)程中，要嚴(yán)格執(zhí)行SOP等規(guī)程要求。體積較大的罐體在滅菌過(guò)程中應(yīng)保證蒸汽暢通及冷空氣排盡。SIP預(yù)熱過(guò)程中，應(yīng)一路進(jìn)氣，避免純蒸汽相互沖撞，將罐體及管道與外界相通的閥門調(diào)節(jié)到適當(dāng)位置，能夠保證“水汽”排出，SIP過(guò)程中注意各閥門的出氣大小。

有條件的企業(yè)可以使用熱成像設(shè)備或手持式溫度檢測(cè)儀來(lái)建立巡查制度。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中取樣一定要注意取樣瓶是否是無(wú)菌狀態(tài)、關(guān)鍵部位消毒、閥門的開關(guān)順序，力求減少取樣時(shí)給罐體所帶來(lái)的污染風(fēng)險(xiǎn)。嚴(yán)格執(zhí)行鏡檢崗位的操作要求，降低革蘭氏染色的錯(cuò)判與誤判。罐體染菌后，禁止開啟罐體與外界相通的閥門并及時(shí)查明雜菌來(lái)源，并采取相應(yīng)措施予以處理。根據(jù)罐體有效培養(yǎng)體積，計(jì)算好培養(yǎng)量，避免培養(yǎng)液面處于攪拌位置而產(chǎn)生泡沫，避免上升至罐頂對(duì)呼吸器造成堵塞，進(jìn)而影響培養(yǎng)參數(shù)的正常調(diào)控。

5 結(jié)束語(yǔ)

現(xiàn)如今，生物制品行業(yè)利用多型號(hào)、大噸位生物反應(yīng)器來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞已趨于常態(tài)，如果無(wú)菌意識(shí)不增強(qiáng)、設(shè)備使用不規(guī)范、硬件設(shè)計(jì)制造不符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，都可能造成罐體污染。以上所列舉只是筆者生產(chǎn)中經(jīng)常遇到及用到的，加強(qiáng)無(wú)菌意識(shí)并且建立規(guī)范化的操作及防治策略尤為重要，盡可能地保證細(xì)胞培養(yǎng)工序穩(wěn)定性及生產(chǎn)可靠性。

［1］周麗薇.細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與防止細(xì)胞污染的方法［J］.醫(yī)學(xué)信息（上旬刊），2010，23（11）：4387-4388.

［2］曾今誠(chéng)，向文玉，孔彬，等.細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中惡臭假單胞菌污染的去除及污染去除后細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的檢測(cè)［J］.廣東醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，33（01）：28-31.

［3］安芳蘭，張榮，武發(fā)菊，等.大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中污染的類型及控制策略探討［J］.甘肅畜牧獸醫(yī)，2016，46（19）：27-30.

［4］曹忠玲.大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)中控制污染的舉措［J］.中國(guó)獸藥雜志，2010，44（02）：56-58.