解雅梅， 周福才*， 楊益眾， 張海波， 蘇宏華， 張 芳， 鄔亞紅揚州大學(xué)園藝與植物保護學(xué)院,江蘇 揚州 5009； 江蘇省植物保護植物檢疫站，江蘇 南京 0036

近20多年來，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷發(fā)展，人們已經(jīng)利用基因工程手段成功培育出了具有抗蟲、抗病和抗除草劑等優(yōu)良性狀的新種質(zhì)，一些抗蟲和耐除草劑的轉(zhuǎn)基因作物品種被廣泛種植(孫越等，2015)。目前，轉(zhuǎn)基因玉米已由單一基因發(fā)展到以既抗蟲又耐除草劑或者抗多種害蟲復(fù)合性狀為主的聚合多基因的階段(沈平等，2016)。這些具有不同殺蟲機理、不同性狀多基因復(fù)合的轉(zhuǎn)基因作物對于雜草的防除和農(nóng)業(yè)害蟲的控制具有重要作用，對減少化學(xué)農(nóng)藥的使用以及保護生態(tài)環(huán)境具有非常重要的意義(Sheltonetal.，2002)。

然而，外源基因的導(dǎo)入可能會使植物的物理性狀發(fā)生改變。對玉米而言，外源BADH基因的導(dǎo)入使得轉(zhuǎn)基因植株相較其非轉(zhuǎn)化受體在生長、生理特性及農(nóng)藝性狀方面有明顯的改變(劉曉璐，2016)；外源AhCMO基因?qū)牒笥衩缀蟠仓甑南嚓P(guān)酶活性及葉綠素含量均高于非轉(zhuǎn)基因玉米，說明耐鹽基因CMO的轉(zhuǎn)化提高了玉米的耐鹽性(任小燕等，2013)。

由于導(dǎo)入的外源基因并非來自于植株本身的基因庫，其對植株本身的抗蟲防御體系將產(chǎn)生一定的影響(施敏娟等，2010)。目前，對于轉(zhuǎn)基因玉米抗蟲防御體系的研究大多集中于植物的生化特性方面，而有關(guān)外來基因插入對植物葉片原有形態(tài)抗性影響的研究較少。本實驗研究外源基因?qū)牒笕~片蠟質(zhì)含量、葉綠素含量、茸毛密度、維管束埋深及Si、K、Ca、S、P和Cl含量等物理性狀的變化，以期為轉(zhuǎn)基因玉米的安全性評價提供基礎(chǔ)資料，并為轉(zhuǎn)基因玉米的科學(xué)、有效利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

大北農(nóng)轉(zhuǎn)基因玉米(轉(zhuǎn)CryAb和epsps基因)、大北農(nóng)(對照)、IE09S034轉(zhuǎn)基因玉米(轉(zhuǎn)CryIE基因)、IE09S034(對照)、808-雙抗-12-5轉(zhuǎn)基因(以下簡稱808轉(zhuǎn)基因)玉米(轉(zhuǎn)CryAb/cry2Aj和Gloevo-epsps基因)、808瑞豐-1(對照)，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所提供。

于2017年6月11日在揚州大學(xué)農(nóng)牧場的實驗田播種各玉米品種，之后均進行常規(guī)的種植管理。分別于6月28日(苗期)、7月25日(穗期)和8月10日(花粒期)進行葉片采集。

1.2 方法

1.2.1 葉片蠟質(zhì)含量的測定 參照馬永亮等(2006)的方法，選取各品種玉米中上部葉片，剪碎并稱取 6.0 g 放入燒杯中，加入 60 mL 氯仿浸泡 1 min，將提取液過濾至已稱重的潔凈燒杯中，放入通風(fēng)櫥中至氯仿?lián)]發(fā)完畢，再次稱重。

葉片蠟質(zhì)含量/(mg·g-1)=(W2-W1)×1000/6.0 g(W1為潔凈燒杯的質(zhì)量，W2為氯仿?lián)]發(fā)完畢后的燒杯質(zhì)量,單位g)。

1.2.2 葉綠素含量的測定 每個玉米品種隨機選取5株，每株玉米選中上部位置相同的葉片1張，用葉綠素計SPAD-502測定葉片的SPAD值。

1.2.3 葉片茸毛密度和維管束埋深的測定 每個玉米品種隨機選取5株，每株玉米選中上部1 cm2面積的葉片1張，在解剖鏡下計數(shù)茸毛數(shù)。取上述實驗后剩下的葉片，選取相同部位用刀片橫切，在顯微鏡下用顯微量尺測量脈維管束的埋深。

1.2.4 葉面部分元素含量的測定 每個玉米品種隨機選取3株玉米，每株玉米選中上部位置相同的葉片1張，利用X射線能譜儀測定葉片背面的Si、K、Ca、S、P和Cl等元素的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel軟件對數(shù)據(jù)進行基本處理，運用DPS統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行分析，同一生育期成對數(shù)據(jù)用t測驗分析其差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源基因?qū)雽τ衩兹~片蠟質(zhì)含量、葉綠素含量、茸毛密度和維管束埋深的影響

從表1發(fā)現(xiàn)，與常規(guī)玉米親本相比，大北農(nóng)轉(zhuǎn)基因玉米葉片的蠟質(zhì)含量、葉綠素含量、茸毛密度和維管束埋深均有一定程度的變化。其中，轉(zhuǎn)基因品種葉片的茸毛密度顯著低于親本(P<0.05)，苗期、穗期和花粒期分別較對照低14.92%、13.97%和17.70%；轉(zhuǎn)基因品種葉片的蠟質(zhì)含量在穗期和花粒期顯著高于親本(P<0.05)，分別高17.95%和12.03%，苗期沒有明顯差異；葉綠素含量和維管束埋深沒有明顯差異。

與常規(guī)玉米親本相比，IE09S034轉(zhuǎn)基因玉米葉片的蠟質(zhì)含量、葉綠素含量、茸毛密度和維管束埋深均有一定程度的變化(表1)。其中，轉(zhuǎn)基因品種葉片的茸毛密度顯著低于親本(P<0.05)，苗期、穗期和花粒期分別較對照低16.85%、14.50%和17.43%；轉(zhuǎn)基因品種葉片的蠟質(zhì)含量和維管束埋深均顯著高于親本(P<0.05)，苗期、穗期和花粒期的蠟質(zhì)含量分別較對照高52.17%、48.30%和35.57%，維管束埋深分別較對照高7.69%、13.70%和10.81%；轉(zhuǎn)基因品種葉片的葉綠素含量在穗期和花粒期顯著高于親本(P<0.05)，分別高18.11%和16.62%，苗期沒有明顯差異。

從表1發(fā)現(xiàn)，與常規(guī)玉米親本相比，808轉(zhuǎn)基因玉米葉片的蠟質(zhì)含量、葉綠素含量、茸毛密度和維管束埋深均有一定程度的變化。其中，轉(zhuǎn)基因品種葉片的茸毛密度在穗期和花粒期顯著低于親本(P<0.05)，分別低14.35%和17.78%；轉(zhuǎn)基因品種葉片的蠟質(zhì)含量和葉綠素含量均顯著高于親本(P<0.05)，苗期、穗期和花粒期的蠟質(zhì)含量分別較對照高18.71%、39.31%和14.47%，葉綠素含量分別高15.88%、13.13%和14.61%；轉(zhuǎn)基因品種葉片的維管束埋深在穗期和花粒期顯著高于親本(P<0.05)，分別高9.21%和14.47%。

表1 不同時期各玉米品種葉片的物理性狀Table 1 Physical characteristics of transgenic vs. control maize leaves in different developmental stages

數(shù)據(jù)為平均值±SD。*和**分別代表轉(zhuǎn)基因玉米品種與其親本間在0.05和0.01水平上差異顯著。

Values are means±SD.*and**indicate significant differences between transgenic maize cultivar and its corresponding control atP<0.05 andP<0.01 level.

2.2 外源基因?qū)雽τ衩兹~片部分元素含量的影響

從表2可以看出，大北農(nóng)轉(zhuǎn)基因品種與其常規(guī)玉米親本葉片的P、Ca、S含量存在顯著差異(P<0.05)。其中，穗期和花粒期轉(zhuǎn)基因玉米葉片中Ca含量分別較對照高64.71%和24.86%，S含量分別高61.18%和42.09%，苗期和花粒期轉(zhuǎn)基因玉米葉片中P含量分別較對照高17.24%和20.00%。Si和Cl含量沒有明顯差異。

IE09S034轉(zhuǎn)基因品種與其常規(guī)玉米親本葉片的Si、K、Ca、S和P含量存在顯著差異(P<0.05)。其中，苗期、穗期和花粒期轉(zhuǎn)基因玉米葉片中Si含量分別較對照高64.71%、110.26%和26.83%；穗期和花粒期轉(zhuǎn)基因玉米葉片中K含量分別較對照高16.67%和13.04%，Ca含量分別高16.67%和13.04%，S含量分別高44.44%和30.88%，P含量分別高46.32%和62.86%。穗期Cl含量較對照高20.00%(表2)。

808轉(zhuǎn)基因品種與其常規(guī)玉米親本葉片的Si、Ca、S、P含量存在顯著差異(P<0.05)。其中，苗期、穗期和花粒期轉(zhuǎn)基因玉米葉片中Si含量分別較對照高29.17%、34.78%和23.81%，Ca含量分別高20.00%、50.52%和26.58%，S含量分別高68.21%、115.47%和87.14%，P含量分別高21.92%、20.41%和10.71%。K和Cl含量沒有發(fā)生顯著變化(表2)。

表2 不同時期各玉米品種葉表面元素含量Table 2 Elemental contents on maize leaf surface in the different developmental stages

數(shù)據(jù)為平均值±SD。*和**分別代表轉(zhuǎn)基因玉米品種與其親本間在0.05和0.01水平上差異顯著。

Values are means±SD.*and**indicate significant differences between transgenic maize cultivar and its corresponding control atP<0.05 andP<0.01 level.

3 小結(jié)與討論

葉片是作物進行光合作用的主要器官，外源基因?qū)霑鹱魑餇I養(yǎng)代謝、物理性狀等發(fā)生變化(劉曉璐，2016； 劉昱，2012； 張迎春，2010)。本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因玉米葉片的蠟質(zhì)含量、葉綠素含量、維管束埋深明顯較常規(guī)親本高，而葉片茸毛密度則較常規(guī)親本低。不同轉(zhuǎn)基因玉米品種葉背面Si、K、Ca等元素含量均在不同程度上大于其常規(guī)親本。

植物的毛、刺、腺體、蠟質(zhì)、分泌物與某些組織的骨化或硅化程度等相關(guān)物理性狀的變化，會影響植物對昆蟲抗性作用(趙曼，2013)。外源基因?qū)胍鹆擞衩兹~片物理性狀的改變，可能是因為植物葉片這些形態(tài)特征的變化對于蟲害具有一定的抵制和防御作用(雒珺瑜等，2011； 任佳等，2014)；外源抗蟲基因的導(dǎo)入恰好調(diào)控了玉米的物理防御系統(tǒng)，使得轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米總體抗性增強，減少了害蟲數(shù)，保持了較好的長勢(呂霞，2013)。

研究發(fā)現(xiàn)，植物葉片的蠟質(zhì)含量、顏色、茸毛密度、表面結(jié)構(gòu)等許多物理性狀與抗蚜性密切相關(guān)。如高粱抗、感基因型間的蠟質(zhì)含量、葉片顏色、葉片表面結(jié)構(gòu)均存在明顯差異，抗蚜品系的蠟質(zhì)含量和葉綠素含量均低于感蚜品系，并且葉片表面光滑(常金華等，2004)；在不同棉花品種(系)間，蚜害指數(shù)與棉花葉片的蠟質(zhì)含量、茸毛密度呈顯著的負相關(guān)(蘆屹，2008)；任佳等(2014)研究發(fā)現(xiàn)，黃瓜葉片茸毛密度與瓜蚜的種群趨勢指數(shù)存在顯著正相關(guān)，葉片維管束埋深和表面蠟質(zhì)含量與瓜蚜種群趨勢指數(shù)呈顯著負相關(guān)。因此，植物葉片的部分物理性狀對其抗蚜性具有重要的影響，而當(dāng)這些物理性狀發(fā)生變化時，必然會造成植物對蚜蟲的抗性作用發(fā)生改變。對于轉(zhuǎn)基因玉米來說，葉片物理性狀的變化對玉米蚜蟲或其他害蟲是否也具有類似的影響？這種影響表現(xiàn)為抑制還是促進？今后還需進行系統(tǒng)的生化和分子實驗，才有可能揭示轉(zhuǎn)基因植物葉表物理特征改變的深層次的機制。

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