呂開(kāi)績(jī)，陳旭東，程開(kāi)，王路得，朱進(jìn)順，Kamara Saidu，張麗芳，朱冠保

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 胃腸外科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 分子病毒與免疫研究所 微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，浙江 溫州 325035）

程序性死亡分子1（programmed death-1，PD-1）及其配體（programmed death ligand-1，PD-L1）是屬于B7家族的協(xié)同刺激分子。PD-1是I型跨膜糖蛋白，由胞外區(qū)、疏水性跨膜區(qū)、細(xì)胞質(zhì)區(qū)組成，CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、NKT細(xì)胞、B細(xì)胞和單核細(xì)胞等在激活后都能表達(dá)PD-1分子[1]。PD-L1也屬I型跨膜蛋白，同樣具有胞外區(qū)、疏水性跨膜區(qū)、細(xì)胞質(zhì)區(qū)，PDL-1可在IFN-γ誘導(dǎo)作用下廣泛表達(dá)于許多腫瘤細(xì)胞表面，研究表明，在黑色素瘤、結(jié)腸癌、肺癌等腫瘤中呈現(xiàn)過(guò)表達(dá)[2]。當(dāng)PD-1與PD-L1結(jié)合后，會(huì)啟動(dòng)T細(xì)胞的抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，顯著抑制T細(xì)胞活化和增殖，導(dǎo)致細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）的凋亡，使得機(jī)體的免疫監(jiān)控?zé)o法識(shí)別腫瘤細(xì)胞，從而可逃避宿主免疫，最終導(dǎo)致腫瘤的進(jìn)一步發(fā)展[3-4]。阻斷該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路后可以恢復(fù)T細(xì)胞的功能，因此PD-1/PD-L1介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路正成為腫瘤治療研究的熱門(mén)靶點(diǎn)。本研究采用原核表達(dá)系統(tǒng)制備了小鼠PD-1胞外區(qū)（mPD-1）及其配體PD-L1胞外區(qū)（mPD-L1）蛋白，并且用mPD-L1蛋白免疫日本大耳兔從而獲得多克隆抗體，并分別應(yīng)用ELISA和免疫熒光的方法，驗(yàn)證了原核表達(dá)的mPD-L1和mPD-1之間的結(jié)合親和性，以及原核表達(dá)的mPD-1和天然mPD-L1之間的結(jié)合親和性，為PD-L1過(guò)表達(dá)的腫瘤的靶向診斷及治療研究提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 pET21a（+）、pGEX 4T-1克隆載體和E.coliBL21（DE3）為本實(shí)驗(yàn)室保存。DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶NedI、XhoI、EcoRI購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；異丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）購(gòu)自美國(guó)默克公司；氨芐青霉素購(gòu)自濟(jì)南齊魯藥廠；弗式佐劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；小鼠抗His mAb、小鼠抗GST mAb購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（H+L）抗體和山羊抗鼠IgG（H+L）抗體、FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG（H+L）和羊抗鼠IgG（H+L）購(gòu)自上海聯(lián)科生物技術(shù)公司；鎳螯合親和層析膠（Ni-NTA Agarose）購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；B16細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室保存；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；健康日本大耳白兔（雌性，體質(zhì)量2.0～2.5 kg），來(lái)自溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（浙）2015-0009。

1.2 方法

1.2.1 pET21a（+）/mPD-L1重組質(zhì)粒的構(gòu)建及mPDL1蛋白原核表達(dá)、純化和鑒定：全基因合成mPD-L1基因序列，經(jīng)過(guò)原核密碼子優(yōu)化后在其上下游引入限制性內(nèi)切酶NedI、XhoI酶切位點(diǎn)，克隆至pET21a（+）載體，構(gòu)建pET21a/mPD-L1重組質(zhì)粒。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pET21a（+）/mPD-L1轉(zhuǎn)化至E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)菌后，接種至15mL LB培養(yǎng)基中（含100μg/mL氨芐青霉素），37℃，震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。再?gòu)囊陨暇褐腥?0μL加至500mL LB培養(yǎng)基中（含100μg/mL氨芐青霉素），37℃，震蕩培養(yǎng)3h。之后經(jīng)終濃度為1.0mmol/L IPTG 37℃ 誘導(dǎo)6h后收菌，12 000r/min離心5min。經(jīng)PBS洗滌、離心、超聲破菌，12 000r/min離心5min收集上清，進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot分析，以His-tag鼠單抗為一抗，用HRP標(biāo)簽的羊抗鼠IgG作為二抗；進(jìn)一步收集經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)的菌液，1 200r/min，5min離心取沉淀，加入8mol/L尿素使其溶解，經(jīng)超聲破菌處理、離心后棄沉淀，取上清，上清中的蛋白經(jīng)過(guò)Ni-NTA Agarose柱純化、洗脫，將收集到的蛋白依次在4、2mol/L尿素中透析2h，最后在PBS緩沖液中透析過(guò)夜。

1.2.2 制備mPD-L1兔多克隆抗體、測(cè)定抗體的效價(jià)并鑒定其特異性：用純化后的mPD-L1蛋白免疫健康的日本大耳白兔，同時(shí)設(shè)計(jì)陰性對(duì)照組。1、3、5周對(duì)兔子進(jìn)行隔周免疫。首次免疫方案：將完全弗氏佐劑與500μg mPD-L1蛋白在冰上等量混合充分乳化，之后二次免疫，將不完全弗氏佐劑與500μg mPD-L1等量混合，其余操作如前。每次對(duì)每只日本大耳白兔進(jìn)行背部皮內(nèi)多點(diǎn)注射。同時(shí)，于0、2、4、6周于兔耳緣靜脈取血，將收集的血液于37℃水浴內(nèi)放置1h，之后3 000r/min，4℃離心，25min，分離血清并分裝，-80℃保存?zhèn)溆?。ELISA檢測(cè)：用包被液緩沖液（0.05mol/L碳酸緩沖液，pH 9.6）稀釋純化的mPD-L1蛋白以10μg/mL的濃度加入酶標(biāo)板孔中，設(shè)2個(gè)復(fù)孔，4℃過(guò)夜；5%脫脂奶粉按1:80稀釋0、2、4、6周血清為一抗，羊抗兔IgG-HRP為二 抗；驗(yàn)證免疫血清中mPD-L1蛋白特異IgG抗體效價(jià)持續(xù)上升后，于第6周從兔心臟取血，收集血清方法如上。第6周血清抗體效價(jià)用間接ELISA法檢測(cè)，將mPD-L1蛋白以10μg/mL的濃度包被96孔板，4℃過(guò)夜，第2天分別將第6周免疫兔血清進(jìn)行倍比稀釋，初始的稀釋度為1:50，之后以5倍的稀釋比倍比稀釋，直至稀釋比為1:781 250，稀釋后的血清為一抗，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG。將96孔板置于酶標(biāo)儀在450 nm處讀取吸光度值，所有血清標(biāo)本均設(shè)置2個(gè)復(fù)孔檢測(cè)，同時(shí)將PBS與弗式佐劑免疫后混合乳化，免疫得到的血清作為陰性對(duì)照。將mPD-L1蛋白經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜，將多克隆兔血清（以1:5 000稀釋）作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（H+L）作為二抗，檢測(cè)兔血清中mPD-L1蛋白特異IgG抗體對(duì)mPD-L1蛋白的特異性識(shí)別和結(jié)合能力。

1.2.3 pGEX-4T-1/mPD-1重組質(zhì)粒構(gòu)建及mPD-1蛋白原核表達(dá)純化和鑒定：全基因合成mPD-1基因序列，經(jīng)原核密碼子優(yōu)化后在其上下游引入限制性內(nèi)切酶XhoI、EcoRI酶切位點(diǎn)，克隆至pGEX-4T-1質(zhì)粒，構(gòu)建pGEX-4T-1/mPD-1重組質(zhì)粒。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/mPD-1轉(zhuǎn)化至宿主菌E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)菌后中，挑單克隆接種于15mL LB液體培養(yǎng)基中（含100μg/mL氨芐青霉素），37℃，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。次日取10mL菌液加至500mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)3h，誘導(dǎo)方法如前。離心收集菌體，先用PBS洗滌1次，然后用適量尿素重懸沉淀，超聲波裂解，12 000r/min，離心5min，取上清和用尿素溶解后的沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果提示上清中含有大量mPD-1蛋白。收集上清，用GST純化柱進(jìn)行純化，用pH 7.3的平衡緩沖液過(guò)柱，然后將獲得的上清上樣，結(jié)束后繼續(xù)加入平衡緩沖液，隨后經(jīng)pH 8.0洗脫緩沖液（含50mmol/L Tris-HCl，10mmol/L還原型谷胱甘肽）將融合蛋白洗脫下來(lái)并收集。將GST-tag單抗為用作一抗，然后用HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（H+L）為二抗，進(jìn)行Western blot分析和鑒定。

1.2.4 ELISA檢測(cè)mPD-1和mPD-L1的親和性：用包被液緩沖液稀釋mPD-L1蛋白至終濃度為10μg/mL，以每孔100μL的量包被ELISA板，4℃過(guò)夜。次日用PBS洗滌3次后用5%脫脂牛奶37℃封閉1h；PBST（含0.5mL/L Tween 20）洗滌3次后，用同濃度脫脂牛奶稀釋mPD-1蛋白，以10μg/mL（100μL）加至包被的孔上37℃反應(yīng)1.5h，PBS-T洗滌4次，加入抗GST小鼠單克隆抗體（1:5 000），37℃反應(yīng)1.5h 后，PBS-T洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（1:10 000），37℃反應(yīng)1h，PBS-T洗滌4次，將TMB顯色液以每孔100μL的量加至96孔板，37℃避光顯色10min，加50μL終止液（2mol/Lh2SO4）終止反應(yīng)。本研究中利用mPD-1攜帶GST標(biāo)簽?zāi)芘cGST-鼠單抗特異性結(jié)合作為檢測(cè)指標(biāo)，分別以未加mPD-1蛋白、mPD-L1蛋白、抗GST單克隆抗體作為3個(gè)陰性對(duì)照，反應(yīng)結(jié)果置酶標(biāo)儀于450 nm處讀取吸光度值，利用Graphpad6.0軟件繪制相應(yīng)圖表。

1.2.5 免疫熒光體外驗(yàn)證mPD-1對(duì)天然PD-L1的親和性：以常規(guī)方法復(fù)蘇傳代以B16細(xì)胞（小鼠黑色素瘤細(xì)胞）。將B16細(xì)胞以10 000/孔的量鋪在48孔板上，同時(shí)加以100 ng/mL的IFN-γ以誘導(dǎo)PD-L1的表達(dá)，設(shè)置陰性對(duì)照，將48孔板放置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)過(guò)夜。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組同時(shí)添加200μg/mL 過(guò)濾后的mPD-1蛋白，孵育6h；用PBS洗滌，經(jīng)4%多 聚甲醛固定15min；0.3% Triton-X100，處理15min。 20%胎牛血清（培養(yǎng)基）封閉1h，37℃。用PBS洗滌后，加一抗（GST-鼠抗1:2 000）37℃ 1h；洗滌后FITC抗鼠37℃孵育1h，PBS-T洗3次。每孔加入的PI 30μL染核5min，之后加入20μL RNA酶抑制劑PBS-T洗3次，避光，載玻片上滴熒光粹滅劑，細(xì)胞面朝下放在載玻片共聚焦顯微鏡下觀察，并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS20.0軟件，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pET21a（+）/mPD-L1重組質(zhì)粒構(gòu)建及mPD-L1蛋白原核表達(dá)、鑒定、純化 mPD-L1全長(zhǎng)663個(gè)堿基，經(jīng)密碼子堿基優(yōu)化后全基因序列合成，并經(jīng)NedI、XhoI酶切位點(diǎn)作用后克隆至克隆載體pET21a（+）內(nèi)，構(gòu)建pET21a（+）/mPD-L1重組質(zhì)粒，之后將重組質(zhì)粒送至測(cè)序，見(jiàn)圖1，經(jīng)測(cè)序鑒定正確。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，重組質(zhì)粒E.coliBL21（DE3）中表達(dá)，一條明顯蛋白條帶出現(xiàn)在相對(duì)分子質(zhì)量為25 kDa的位置，與預(yù)期蛋白大小相一致。同時(shí)將純化后的mPDL1蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析，在相對(duì)分子質(zhì)量25 kDa的位置處同樣出現(xiàn)與預(yù)期蛋白大小相一致的單一的蛋白條帶。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，在25 kDa處出現(xiàn)同樣單一反應(yīng)帶，見(jiàn)圖2。

圖1 重組質(zhì)粒pET21a（+）/mPD-L1構(gòu)建和鑒定圖

2.2 mPD-L1兔多克隆抗體效價(jià)測(cè)定及特異性鑒定 將純化后的PD-L1蛋白作為包被抗原檢測(cè)兔0、2、4及6周血清mPD-L1特異性IgG抗體的效價(jià)，mPD-L1蛋白免疫組兔血清于免疫后第2周開(kāi)始，多克隆抗體效價(jià)逐漸升高，至第6周達(dá)高峰。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，第6周mPD-L1蛋白免疫組兔多克隆抗體IgG的效價(jià)可達(dá)1:156 250。多克隆抗體經(jīng)Western blot鑒定后在25 kDa處出現(xiàn)單一條帶，見(jiàn)圖3。

2.3 pGEX-4T-1/mPD-1重組質(zhì)粒構(gòu)建及mPD-1蛋白原核表達(dá)、鑒定和純化 mPD-1蛋白全長(zhǎng)447個(gè)堿基，經(jīng)原核密碼子堿基優(yōu)化后送至公司全基因合成，并經(jīng)EcorI、XhoI酶切位點(diǎn)克隆至pGEX-4T-1載體，構(gòu)建pGEX-4T-1/mPD-1重組質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序鑒定正確，見(jiàn)圖4。重組質(zhì)粒經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，收菌后得到的菌液用PBS溶解，之后超聲裂解后取上清，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析后在相對(duì)分子質(zhì)量約40 kDa的位置得到一條明顯蛋白條帶，與預(yù)期蛋白大小相符。同時(shí)將純化后的mPD-1蛋白經(jīng)上述電泳方法進(jìn)行分析，結(jié)果顯示純化后的蛋白與預(yù)期蛋白大小相符。經(jīng)Western blot檢測(cè)，在40 kDa處出現(xiàn)單一反應(yīng)帶，見(jiàn)圖5。2.4 ELISA法檢測(cè)mPD-1/mPD-L1結(jié)合活性 實(shí)驗(yàn)組（PD-L1+PD-1+GST）與對(duì)照組（PD-L1+GST、PD-1+GST、PD-L1+PD-1）的OD450值分別為0.907±0.038、0.016±0.001、0.063±0.009、0.018±0.001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明mPD-1蛋白與mPD-L1蛋白在體外能夠特異性結(jié)合，具有良好的親和性。2.5 體外免疫熒光的親和性驗(yàn)證 在經(jīng)IFN-γ誘導(dǎo)后的B16細(xì)胞膜可見(jiàn)強(qiáng)綠色的點(diǎn)狀或團(tuán)塊狀綠色熒光斑點(diǎn)，而未經(jīng)IFN-γ誘導(dǎo)的細(xì)胞株未見(jiàn)明顯的綠色熒光斑點(diǎn)，見(jiàn)圖6。

圖2 mPD-L1蛋白的SDS-PAGE及Western blot圖

圖3 兔多克隆抗體的效價(jià)測(cè)定以及特異性鑒定

3 討論

PD-L1和PD-1特異性結(jié)合后會(huì)負(fù)性調(diào)控在活化T細(xì)胞表面的PD-L1所介導(dǎo)的信號(hào)通路，從而使T細(xì)胞的活化和增殖受到顯著抑制，并且導(dǎo)致某些細(xì)胞因子表達(dá)和分泌失常，如IFN-γ、IL-2。已有研究發(fā)現(xiàn)PD-L1調(diào)控的免疫耐受能夠?qū)е履[瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視以及某些病毒的慢性感染及其他多種相關(guān)的自身免疫性疾病[5-8]。PD-L1能夠在IFN-γ誘導(dǎo)后高效地表達(dá)在腫瘤細(xì)胞表面，進(jìn)一步加劇PD-1/PD-L1通路的抑制性調(diào)控信號(hào)，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)異常低下的免疫功能，T細(xì)胞部分甚至全部喪失功能，淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答受到抑制，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃避CTL的殺傷和清除[9]。研究表明，利用PD-1或PDL1的抗體特異性阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)通路途徑，可恢復(fù)T細(xì)胞活性，并抑制腫瘤的生長(zhǎng)[11]，因此，阻斷PDL-1/PD-1介導(dǎo)的負(fù)性調(diào)控機(jī)制已成為臨床上腫瘤免疫療法或抗病毒感染治療的新策略，干擾PD-1/PD-L1信號(hào)途徑已成為目前治療PD-L1表達(dá)腫瘤的新方法[11-13]。目前，美國(guó)FDA已經(jīng)批準(zhǔn)PD-1/PD-L1單克隆抗體上市用于治療PD-L1高表達(dá)的腫瘤，如：Atezolizumab、Durvalumab、Avelumab。

本研究采用原核表達(dá)系統(tǒng)，高效表達(dá)并且純化mPD-L1和mPD-1蛋白，發(fā)現(xiàn)mPD-1蛋白存在于上清中，因此利用GST純化柱將其純化，而mPD-L1蛋白則存在于包涵體內(nèi)，因此用變性緩沖液將其變性，之后再用尿素梯度透析將其復(fù)性并且用Western blot將獲得的蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。利用mPD-L1免疫日本大耳白兔制備了mPD-L1的多克隆抗體，并且通過(guò)ELISA測(cè)定該抗體的效價(jià)，通過(guò)Western blot鑒定該抗體的特異性，結(jié)果顯示多克隆抗體在1:156 250稀釋時(shí)仍然有較高的效價(jià)，并且能夠特異性識(shí)別mPD-L1蛋 白，后期可以將該抗體用于組織水平驗(yàn)證PD-L1的表達(dá)。該多克隆抗體與本實(shí)驗(yàn)室制備的其他抗體一 樣，均有較高的效價(jià)以及良好的特異性[14]。進(jìn)一步采用ELISA，通過(guò)與對(duì)照組的對(duì)比，發(fā)現(xiàn)mPD-L1蛋 白與mPD-1蛋白在體外能夠結(jié)合，應(yīng)用免疫熒光驗(yàn)證了mPD-1能夠與細(xì)胞表面天然存在的PD-L1蛋白結(jié)合。

綜上所述，經(jīng)原核細(xì)胞表達(dá)并純化后獲得的mPD-L1和mPD-1蛋白之間具有良好的親和性，同時(shí)本研究在細(xì)胞水平驗(yàn)證了mPD-1蛋白與細(xì)胞表面的天然PD-L1之間也具有特異性結(jié)合的親和性。mPD-1能否阻斷在體PD-1/PD-L1通路達(dá)到腫瘤的治療作用尚待后續(xù)進(jìn)一步研究。通過(guò)同源性匹配分析發(fā)現(xiàn)人源性PD-L1全長(zhǎng)蛋白和鼠源性PD-L1全長(zhǎng)蛋白同源性達(dá)到69%，其胞外區(qū)蛋白的同源性達(dá)到了73%。因此，本研究獲得的mPD-1原核蛋白也可為人源PD-L1陽(yáng)性腫瘤的診斷和治療方面的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

圖4 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/mPD-1構(gòu)建和鑒定圖

圖5 mPD-1蛋白的SDS-PAGE以及Western blot圖

圖6 mPD-L1兔多克隆抗體間接免疫熒光檢測(cè)（×400）

[1] GREENWALD R J, FREEMAN G J, SHARPE A H. The B7 family revisited[J]. Annu Rev Immunol, 2005, 23: 515-548.

[2] 覃曉林, 劉朝奇, 楊凡, 等. 小鼠P D L-1胞外區(qū)基因表達(dá)、純化及其多克隆抗體的制備[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2010, 26(6): 569-571.

[3] DAY C L, KAUFMANN D E, KIEPIELA P, et al. PD-1 expressionon HIV specific T cells is associated with T-Cell exhaustion and disease progression[J]. Nature, 2006, 443(7109): 350-354.

[4] MUMPRECHT S, SCHURCH C, SCHWALLER J, et al.PD-1 signaling onchronicmyeloid leukemia-Specific T cells results in T cell exhaustion and disease progression[J].Blood, 2009, 114(8): 1457-1458.

[5] PLEGE A, BORNS K, BAARS W, et al. Suppression of human T-cell activation and expansion of regulatory T cells by pig cells over expressing PD-ligands[J]. Transplantation,2009, 87(7): 975-982.

[6] WANG S, BAJORATH J, FLIES D B, et al. Molecular modeling and functional mapping of B7-H1 and B7-DC uncouple costimulatory function from PD-1 interaction[J]. J Exp Med, 2003, 197(9): 1083-1091.

[7] GAO Q, WANG X Y, QIU S J, et al. Over expression of PDL1 significantly associates with tumor aggressiveness and postoperative recurrence in human hepatocellular carcinoma[J]. Clin Cancer Res, 2009, 15(3): 971-979.

[8] KEIR M E, FRANCISCO L M, SHARPE A H. PD-1 and its ligands in T-cell immunity[J]. Curr Opin Immunol, 2007, 19(3): 309-314.

[9] IWAI Y, TERAWAKI S, IKEGAWA M, et al. PD-1 inhibits antiviral immunity at the effecctor phase in the liver[J]. J Exp Med, 2003, 198(1): 39-50.

[10] DONG H, STROME S E, SALOMAO D R, et al. Tumorassociated B7-H1 promotes T-cell apoptosis:A potential mechanism of immune vasion[J]. Nat Med, 2002, 8(8):793-800.

[11] REYNOSO E D, ELPEK K G, FRANCISCO L, et al. Intestinal tolerance is converted to autoimmune enteritis upon PD-1 ligand blockade[J]. J Immunol, 2009, 182(4): 2102-2112.

[12] NIKOLOVA M, LELIEVRE J D, CARRIERE M, et al. Regulatory T cells differentially modulate the maturation and apoptosis ofhuman CD8+ T-cell subsets[J]. Blood, 2009,113(19): 4556-4565.

[13] 賀宇飛, 張桂梅, 王小紅, 等. P D-1胞外段c D N A在真核細(xì)胞的表達(dá)與其功能鑒定[J]. 生物工程學(xué)報(bào), 2004, 20(5):699-703.

[14] 蔡一奇, 程開(kāi), 陳旭東, 等. M A G E-A 3多克隆抗體的制備及在胃癌細(xì)胞檢測(cè)中的應(yīng)用[J]. 溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2017,47(5): 318-324.