陳千杰，張金三，郭強(qiáng)，董晶萊，郭麗莎，李校堃

（溫州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 溫州 325035）

胰腺癌是惡性腫瘤，患者5年生存率不足5%[1]。 其增殖、侵襲能力極強(qiáng)，往往在發(fā)病早期即發(fā)生轉(zhuǎn)移，是治療的難點(diǎn)[2-4]。Yes-關(guān)聯(lián)蛋白1（Yesassociate protein 1，YAP1）作為Hippo通路的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄輔助因子在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中有重要作用[5]，但相關(guān)機(jī)制仍不明了。YAP1具有調(diào)控細(xì)胞存活和增殖作用，參與癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transitions，EMT）[6]。EMT是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[7-8]。YAP1通過與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合參與胚胎發(fā)育進(jìn)程[7，9-12]，在胚胎發(fā)育中起重要作用的因子，在癌變過程中往往被激活[13-14]。 當(dāng)抑制KRAS后，會上調(diào)YAP1的表達(dá)，使YAP1直接參與腫瘤的形成[15-17]。本研究構(gòu)建敲除YAP1基因的L3.6細(xì)胞，檢測YAP1對L3.6細(xì)胞的增殖及遷移能力的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 人胰腺癌細(xì)胞株L3.6購自美國模式培養(yǎng)物集存庫；pSpCas9（BB）-2A-Puro V2載體購自美國Addgene公司；DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶、1%青鏈霉素、胎牛血清購于美國Gibco公司；RNA提取試劑購于美國Invitrogen公司；EndoFectinTMMax轉(zhuǎn)染試劑購自廣州復(fù)能基因有限公司；考馬斯亮藍(lán)購自上海碧云天生物公司；YAP（D8H1X）XP Rabbit抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，GAPDH 單克隆抗體購自英國Abcam公司；Western blot相關(guān)試劑、羊抗小鼠IgG二抗與羊抗兔IgG二抗購自武漢博士德生物科技有限公司；正置、倒置熒光顯微鏡購自日本尼康公司；PCR儀、電泳儀、電泳槽、化學(xué)發(fā)光成像儀購自美國Bio-Rad公司，BD Accuri C6流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；NanoDrop 2000C超微量分光光度計購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；酶聯(lián)免疫檢測儀購自美谷分子儀器（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：L3.6細(xì)胞在含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，常規(guī)置于37℃、5% CO2環(huán)境下生長。細(xì)胞融合至80%左右時常規(guī)傳代。

1.2.2YAP1敲除載體的構(gòu)建：采用CRISPR-Cas9技術(shù)在L3.6細(xì)胞中敲除YAP1基因。首先針對YAP1基因的第1個外顯子序列，篩選出最佳的先導(dǎo)序列：5’-CATCAGATCGTGCACGTCCG-3’，并據(jù)此設(shè)計合成用于pSpCas9-KOYAP1構(gòu)建的寡聚核苷酸序列：oligo1： 5’-CACCGCATCAGATCGTGCACGTCCG-3’，oligo2：5’-AAA CCGGACGTGCACGATCTGATGC-3’。經(jīng)磷酸化修飾，并退火成雙鏈后，連接克隆到BbsI酶切和去磷酸化修飾的pSpCas9（BB）-2A-Puro V2載體。轉(zhuǎn)化到感受態(tài)的大腸桿菌DH5α后，挑單克隆提取質(zhì)粒和測序分析，驗證得到正確克隆的質(zhì)粒。

1.2.3 篩選YAP1敲除的L3.6穩(wěn)定細(xì)胞株：用CRISPRCas9-YAP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染L3.6細(xì)胞24h后，經(jīng)過嘌呤霉素篩選48h，再采用有限稀釋法，將單細(xì)胞懸液按50、100和200個細(xì)胞/皿的密度接種于10 cm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)14 d，讓腫瘤細(xì)胞生長成單克隆團(tuán)，然后用克隆環(huán)定點(diǎn)消化各個克隆并接種至24孔板中，細(xì)胞生長至布滿24孔板底75%時收集細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)以后，裂解獲得細(xì)胞蛋白，應(yīng)用Western blot法檢測L3.6細(xì)胞的YAP1蛋白表達(dá)以驗證YAP1敲除是否成功。

1.2.4 Western blot檢測蛋白表達(dá)：分別收集WT組細(xì)胞（L3.6野生型細(xì)胞）和YAP1-KO組細(xì)胞（已敲除內(nèi)源YAP1基因的L3.6細(xì)胞），細(xì)胞裂解液4℃裂解，12 000r/min離心，提取各組細(xì)胞總蛋白，用Bradford法測量蛋白濃度。變性后的蛋白樣本進(jìn)行10% SDS-PAGE凝膠電泳，用孔徑0.45 μm的PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，封閉后用YAP1（1:1 000）、GAPDH（1:5 000）抗體雜交。TBST洗膜3次/7min，再加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔（鼠）二抗（1:10 000）室溫?fù)u床孵育1h，TBST洗3次后，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光并分析結(jié)果。

1.2.5 MTT法檢測細(xì)胞增殖情況：分別取對數(shù)生長期的WT組及YAP1-KO組細(xì)胞，鋪到60 mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞匯合到70%～80%后，胰酶消化，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并計數(shù)，將稀釋好的細(xì)胞懸液以每孔2×103個細(xì)胞接種于96孔板，每組細(xì)胞做6個復(fù)孔。放置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)1、2、3、4、5、6 d后，每孔加入10μL MTT溶液（5 mg/mL），在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸棄上清，加入150μL DMSO溶液，于490 nm波長時測各孔吸光度值并記錄結(jié)果。重復(fù)實(shí)驗3次，取均值。

1.2.6 EdU細(xì)胞標(biāo)記和流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期：分別提前1 d將WT組及YAP1-KO組細(xì)胞以1×105個/mL濃度接種于培養(yǎng)皿中，以調(diào)整為細(xì)胞最優(yōu)狀態(tài)，待細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%時，用不含EDTA的胰蛋白酶消化分裝（操作過程要輕柔），離心，4%多聚甲醛固定20min后，2 mg/mL甘氨酸中和5min，0.5% Triton X-100滲透后，加500μL的1×Apollo?染色反應(yīng)液，重懸細(xì)胞，避光室溫孵育10min后，1 500r/min 離心5min，棄染色反應(yīng)液。0.5% Triton X-100滲透劑室溫清洗1～3次，PBS重懸，置于流式細(xì)胞儀中檢測，觀察增殖細(xì)胞的染色情況。

1.2.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗檢測細(xì)胞遷移能力：提前用馬克筆在6孔板背后，每孔均勻畫3條等距離橫線，然后每孔鋪約7×105個細(xì)胞，待次日觀察細(xì)胞已長滿皿底，用10μL小槍頭比著直尺垂直于背后的橫線劃痕。PBS洗細(xì)胞3次，去除脫了漂浮的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基，放入37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱。按第1、第2、第3天的同一時間點(diǎn)取出6孔板，置于顯微鏡下觀察同一位置細(xì)胞遷移變化，最后拍照記錄。重復(fù)本實(shí)驗3次，取均值。

1.2.8 Transwell實(shí)驗檢測細(xì)胞遷移能力：首先消化并收集各組細(xì)胞，離心，用無血清培養(yǎng)基重懸并計數(shù)，以200μL共1×105個/孔的細(xì)胞密度鋪至小室的上室。下室內(nèi)加入500μL含20%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱24h。培養(yǎng)結(jié)束后取出小室，用棉簽小心擦去微孔膜上層未穿過膜的細(xì)胞，將小室用PBS浸泡清洗3次/5min， 4%多聚甲醛固定35min，0.1%結(jié)晶紫對微孔膜下細(xì)胞染色25min，再用PBS浸泡清洗3次/5min，至膜上背景紫色基本消失，用倒置顯微鏡觀察微孔膜。每組設(shè)定3個復(fù)孔實(shí)驗，取均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，2組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRISPR-Cas9載體及YAP1敲除細(xì)胞株構(gòu)建 如圖1所示，構(gòu)建的pSpCas9-KOYAP1質(zhì)粒經(jīng)測序分析表明插入的序列及位點(diǎn)正確，目的基因YAP1的敲除載 體質(zhì)粒構(gòu)建成功。為獲得YAP1敲除的穩(wěn)定細(xì)胞系，用上述CRISPR-Cas9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胰腺癌細(xì)胞系L3.6，篩選后產(chǎn)生的單克隆團(tuán)（見圖2A），分離培養(yǎng)后，獲穩(wěn)定細(xì)胞株。經(jīng)Western blot驗證，相對于WT組，YAP1-KO組細(xì)胞中的YAP1蛋白表達(dá)完全缺失，說明成功獲得了YAP1敲除的L3.6穩(wěn)定細(xì)胞株（見圖2B）。

2.2 檢測敲除YAP1前后細(xì)胞增殖能力的變化 為檢測YAP1基因敲除對細(xì)胞增殖的影響，采用MTT實(shí)驗構(gòu)建細(xì)胞生長曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對于野生型的WT組細(xì)胞，YAP1-KO組細(xì)胞的增殖速度明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖3A。進(jìn)一步采用EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗結(jié)合流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞周期分布，發(fā)現(xiàn)YAP1-KO組及WT組細(xì)胞的EdU陽性率，即處于S期的細(xì)胞數(shù)所占各自總細(xì)胞數(shù)的比例，分別為37.4%和54.7%，見圖3B。此結(jié)果表明Cas9敲除YAP1基因表達(dá)顯著抑制胰腺癌細(xì)胞L3.6的增殖能力。

圖1 用于YAP1基因敲除的質(zhì)粒測序圖譜（下劃線為設(shè)計插入的先導(dǎo)序列）

圖2 YAP1基因敲除細(xì)胞株的構(gòu)建

2.3 YAP1對胰腺癌細(xì)胞體外遷移能力的影響 為了觀察YAP1基因敲除對胰腺癌L3.6體外遷移的影響，采用劃痕實(shí)驗來比較細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，WT組在第1、第2、第3天的劃痕閉合進(jìn)程日漸明顯，而YAP1-KO組劃痕幾乎沒有閉合，表明WT組細(xì)胞的遷移速度隨著時間的推進(jìn)而增加，在第3天達(dá)到最大值，但是YAP1-KO組的遷移速度明顯下降，幾乎喪失遷移能力。2組細(xì)胞各時間段對應(yīng)的遷移情況差異明顯（見圖4A）。進(jìn)一步的Transwell實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，在所有觀察的時間點(diǎn)，YAP1-KO組細(xì)胞轉(zhuǎn)移、穿透到下室的細(xì)胞數(shù)量與WT組比較均顯著降低（見圖4B）。

圖3 比較YAP1敲除前后L3.6細(xì)胞的增殖情況

3 討論

YAP1作為Hippo通路下游的主要效應(yīng)蛋白之一，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用逐漸被認(rèn)知。絕大部分的胰腺癌中存在KRAS突變，但研究發(fā)現(xiàn)抑制KRAS后，復(fù)發(fā)的胰腺癌中存在YAP1的過度激活，并且使胰腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)[16-17]。這提示過表達(dá)YAP1在胰腺癌復(fù)發(fā)、惡性化的過程中起重要作用，但是其機(jī)制仍不明確。盡管人們已經(jīng)認(rèn)識到Y(jié)AP1參與部分腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移的進(jìn)程，但是對胰腺癌細(xì)胞YAP1缺失后的增殖及轉(zhuǎn)移能力的具體變化還鮮有涉及。因此本研究利用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建YAP1敲除的穩(wěn)定胰腺癌細(xì)胞系，通過一系列細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗，檢測敲除YAP1后對胰腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力的影響。

圖4 YAP1敲除對L3.6細(xì)胞遷移能力的影響（×10）

CRISPR-Cas9技術(shù)是當(dāng)下熱門的基因編輯技術(shù)。該技術(shù)可以方便、快捷地編輯細(xì)胞的基因組，在DNA水平調(diào)控目的蛋白的表達(dá)、突變[18-19]。在本研究 中，我們設(shè)計了針對YAP1的寡聚核苷酸的先導(dǎo)序列，基于pSpCas9（BB）-2A-Puro的載體，構(gòu)建了CRISPRCas9-YAP1質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染L3.6細(xì)胞后，經(jīng)過抗性篩選和單克隆化以后，成功獲得了敲除YAP1基因的L3.6細(xì)胞，標(biāo)記為YAP1-KO細(xì)胞株。經(jīng)驗證，其YAP1蛋白已經(jīng)被完全敲除，且經(jīng)多次傳代后，細(xì)胞性狀仍保持穩(wěn)定，能進(jìn)行下一步的增殖、遷移等生物學(xué)功能實(shí)驗。

細(xì)胞的惡性增殖與轉(zhuǎn)移在腫瘤的初發(fā)-惡性化過程中起著關(guān)鍵作用[20-21]，由于癌細(xì)胞增殖速度快，從腫瘤原發(fā)灶侵襲近端的正常組織并發(fā)生遷移到遠(yuǎn)端臟器，甚至擴(kuò)散到全身，因此癌細(xì)胞的增殖和遷移能力在腫瘤研究過程中至關(guān)重要[22-23]。本課題利用經(jīng)Cas9技術(shù)敲除胰腺癌細(xì)胞中YAP1基因的模型，研究YAP1缺失對胰腺癌細(xì)胞增殖及遷移能力的影響，為此后進(jìn)一步解析YAP1在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)，結(jié)果表明YAP1缺失后，能顯著抑制胰腺癌L3.6細(xì)胞的增殖和遷移能力。EdU是胸腺嘧啶類似物，能在細(xì)胞增殖中代替胸腺嘧啶，嵌入復(fù)制中的DNA分子內(nèi)，通過EdU與熒光染料的特異性結(jié)合，探測熒光信號，從而檢測細(xì)胞中DNA的復(fù)制活性，計算新增殖的細(xì)胞數(shù)量。MTT可以被細(xì)胞增殖過程中線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成深紫色產(chǎn)物，當(dāng)細(xì)胞增殖數(shù)越多，則在570 nm波長吸光度越高，因而被廣泛用于監(jiān)測細(xì)胞增殖變化。本研究發(fā)現(xiàn)YAP1-KO組L3.6細(xì)胞的EdU陽性增殖率（即處于S期的細(xì)胞比例）和MTT吸光度（即細(xì)胞的相對活性）明顯低于WT組的L3.6細(xì)胞，表明敲除YAP1后，細(xì)胞周期受到阻滯，DNA復(fù)制活性、線粒體活性降低，表明YAP1敲除的胰腺癌細(xì)胞的增殖能力受到抑制。細(xì)胞劃痕法可以測定細(xì)胞的遷移能力，其借鑒體外細(xì)胞致傷愈合模型，在體外培養(yǎng)的單層細(xì)胞上，劃痕致傷，然后比較各組細(xì)胞間的遷移能力。Transwell是在上室接種細(xì)胞，下室加入FBS或特定趨化因子如FGF，細(xì)胞可能會穿透過聚碳酸酯膜向營養(yǎng)成分高的下室轉(zhuǎn)移，對下室的細(xì)胞染色，可直觀反映細(xì)胞的遷移情況。本研究結(jié)果顯示YAP1缺失的胰腺癌細(xì)胞，其劃痕愈合和穿透過膜等遷移能力受到極大地抑制。

綜上所述，在胰腺癌L3.6細(xì)胞敲除內(nèi)源YAP1后，其增殖和轉(zhuǎn)移能力明顯減弱，這揭示YAP1有望成為治療胰腺癌的新靶標(biāo)。

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