楊永江，吳恩蕓，禹保軍，劉容秀，馬博妍，岳仁寬，劉麗霞，張 麗

（西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州730030）

TLR2基因是Toll樣受體（Toll-like receptor,TLR）蛋白基因家族的重要成員之一，在機(jī)體介導(dǎo)天然免疫和抗病抗感染方面起著重要的作用[1-2]。TLR在機(jī)體內(nèi)分布廣泛，其中TLR2基因主要分布于免疫細(xì)胞如單核細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，協(xié)同TLR4連接天然免疫和獲得性免疫[3]。已有大量研究證實(shí)，過(guò)度的免疫反應(yīng)所致的自身免疫疾病和慢性炎癥均與TLR2在體內(nèi)的過(guò)度表達(dá)有關(guān)[4]。TLR2基因識(shí)別譜廣，可識(shí)別大部分已發(fā)現(xiàn)的病原相關(guān)分子模式（Pathogen associated molecular patterns，PAMP）結(jié)構(gòu)，Beutler等[5]認(rèn)為T(mén)LR2識(shí)別PAMP后介導(dǎo)的過(guò)激天然免疫應(yīng)答與敗血癥的發(fā)生密切相關(guān)。因此，TLR2拮抗劑在疾病的防治和治療中的負(fù)調(diào)控機(jī)制是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)[6]。NO在機(jī)體內(nèi)起著信使分子的作用，Thoma-Uszynski等[7]的研究結(jié)果表明結(jié)核分枝桿菌的脂蛋白可通過(guò)刺激小鼠的TLR2，從而誘發(fā)NO依賴性的殺菌活性。此外在TLR2介導(dǎo)活化效應(yīng)的大量研究中，單克隆抗體的試圖制備進(jìn)一步為研制抗感染及信號(hào)阻斷新藥品打下基礎(chǔ)[8]。牛TLR2基因定位于17號(hào)染色體上[9]，含2個(gè)外顯子，基因全長(zhǎng)13.2 kb，其中mRNA序列全長(zhǎng)3.5 kb，編碼784個(gè)氨基酸。

研究表明在乳房炎患病的中國(guó)荷斯坦牛乳腺細(xì)胞內(nèi)TLR2呈現(xiàn)過(guò)度表達(dá)狀態(tài)[10]。國(guó)內(nèi)關(guān)于TLR2基因在奶牛乳房炎上研究較少。馬騰壑等[11]僅發(fā)現(xiàn)1個(gè)SNP（single nucleotide polymorphism，SNP）可能與奶牛的乳房炎抗性有關(guān)。DNA池技術(shù)是提取具有某一共同特征群體DNA為模板按比例混合成池，這種混合DNA樣品再經(jīng)PCR擴(kuò)增測(cè)序后，結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳或聚丙酰胺凝膠電泳（PAGE）結(jié)合測(cè)序可直接檢測(cè)出SNPs的一種方法。袁崢嶸等[12]應(yīng)用DNA池測(cè)序技術(shù)檢測(cè)牛CACNA2D1基因多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)了變異位點(diǎn)，并利用公式估算等位基因頻率。本研究以荷斯坦牛為研究對(duì)象，利用DNA池技術(shù)和直接測(cè)序技術(shù)篩選TLR2基因部分序列的SNPs，并通過(guò)等位基因頻率的估算，發(fā)現(xiàn)SNPs突變前后等位基因頻率有明顯差異，以期為更深入研究荷斯坦牛TLR2基因與乳房炎抗性及分子遺傳育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料350頭中國(guó)荷斯坦牛血樣，采自寧夏農(nóng)墾賀蘭山奶業(yè)有限公司。每頭牛耳靜脈采血8 mL，裝于真空管中，-20℃保存。采用血液基因組提取試劑盒對(duì)DNA進(jìn)行提取，提取效果利用2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，樣品濃度用分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量，去離子水溶解稀釋，各DNA樣品吸取1 μL構(gòu)建DNA池。

1.2 引物設(shè)計(jì)和PCR反應(yīng) 根據(jù)GenBank中收錄的荷斯坦牛TLR2基因的DNA序列（NM_174197），利用Primer 5.0軟件對(duì)4對(duì)特異性引物進(jìn)行設(shè)計(jì)（表1），用以擴(kuò)增荷斯坦牛TLR2基因序列。PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體系為40 μL：基因組DNA 2 μL，上、下游引物各0.9 μL，Taq PCR MasterMix試劑24.2 μL，ddH2O 12 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性4 min；95℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s，28個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存，采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照觀察。

1.3 等位基因頻率估算 利用測(cè)序圖看圖軟件Chromas.exe和MWSnap軟件中的標(biāo)尺，測(cè)量荷斯坦牛各突變位點(diǎn)等位基因的峰高，再根據(jù)公式Fi=hi/（h1+h2）估算等位基因頻率[13]。其中Fi表示某突變位點(diǎn)等位基因頻率（i=1，2），h1表示測(cè)序峰圖中該突變位點(diǎn)等位基因1的峰高度；h2表示測(cè)序峰圖中該突變位點(diǎn)等位基因2的峰高度。

表1 引物信息Table 1 The information of primers

2 結(jié)果與分析

2.1 荷斯坦牛TLR 2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果 將4對(duì)特異性引物C1、C2、C3、C4經(jīng)DNA池?cái)U(kuò)增，取產(chǎn)物2 μL，在1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，在150 V，15 min條件下進(jìn)行擴(kuò)增（見(jiàn)圖1），分別出現(xiàn)大小約為200～300 bp左右的清晰條帶，與預(yù)期目的片段長(zhǎng)度相符。

圖1 荷斯坦牛TLR2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Detections of PCR products of TLR2 gene in Holstein cattle

2.2 DNA池?cái)U(kuò)增產(chǎn)物序列測(cè)定及等位基因頻率估算以中國(guó)荷斯坦牛DNA池為原料，通過(guò)試驗(yàn)設(shè)計(jì)的4對(duì)引物C1、C2、C3和C4經(jīng)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果比對(duì)Genbank中牛TLR2基因發(fā)現(xiàn)基因頻率前后有明顯差異，利用Seqman軟件對(duì)SNPs進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)6個(gè)SNPs，第2內(nèi)含子602 bp處胸腺嘧啶（T）→胞嘧啶（C）的堿基轉(zhuǎn)換和第2外顯子10 900、11 047、11 096和12 077 bp處分別發(fā)生鳥(niǎo)嘌呤（G）→胞嘧啶（C）、鳥(niǎo)嘌呤（G）→胞嘧啶（C）、腺嘌呤（A）→胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）→胸腺嘧啶（T）的堿基轉(zhuǎn)換（見(jiàn)圖2），分別命名為T(mén)602A、G10900C、G11047C、A11076T和C12077T。其中第2外顯子10 634 bp處發(fā)生胸腺嘧啶（T）→鳥(niǎo)嘌呤（G）的堿基轉(zhuǎn)換，命名為T(mén)10634G，導(dǎo)致該基因編碼的蛋白質(zhì)氨基酸由谷氨酸（Gly）轉(zhuǎn)變?yōu)樘於彼幔ˋsp）；另外分別測(cè)量中國(guó)荷斯坦牛測(cè)序峰圖中6個(gè)SNPs等位基因相應(yīng)峰高度，并根據(jù)公式給出各突變位點(diǎn)的等位基因頻率估算（見(jiàn)表2）。

表2 等位基因頻率估算Table 2 Estimation of allele frequency

圖2 測(cè)序分析結(jié)果Fig.2 Results of sequencing

3 討論

本研究用350個(gè)中國(guó)荷斯坦牛血樣構(gòu)建了DNA混合池研究TLR2基因，結(jié)合直接測(cè)序技術(shù)和克隆測(cè)序技術(shù)獲得基因序列，混合樣品某些特異性位點(diǎn)再經(jīng)過(guò)PCR反應(yīng)后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、測(cè)序等方法估算等位基因頻率，確定某位點(diǎn)與對(duì)應(yīng)性狀相關(guān)性[14]。DNA池進(jìn)行直接測(cè)序時(shí)所要求的頻率應(yīng)大于10%[15]。利用MWSnap標(biāo)尺測(cè)量測(cè)定峰高等位基因頻率小于10%時(shí)，會(huì)對(duì)結(jié)果準(zhǔn)確度造成一定影響，本研究中突變頻率均大于10%，因此數(shù)據(jù)可靠。本試驗(yàn)DNA池構(gòu)建方式為DNA模板等摩爾混合。因此，DNA定量的精確性對(duì)試驗(yàn)結(jié)果會(huì)造成相應(yīng)的干擾，應(yīng)適當(dāng)校正。

近年來(lái)，在奶牛上國(guó)內(nèi)外對(duì)TLR2的研究較少，主要集中于乳房炎抗性標(biāo)記。馬騰壑等[11]在荷斯坦牛、三河牛和中國(guó)西門(mén)塔爾牛TLR2基因中鑒定到3個(gè)SNPs位點(diǎn)；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TLR2基因與奶牛乳房炎性狀顯著相關(guān)；張翠霞等[16]在中國(guó)荷斯坦牛TLR2基因中鑒定出3個(gè)SNP位點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TLR2基因在奶?？共⌒陨嫌兄匾饔?；白杰等[17]在151頭新疆褐牛和138頭中國(guó)荷斯坦奶牛TLR2中鑒定到3個(gè)SNPs位點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，易感乳房炎的突變基因與TLR2基因顯著相關(guān)。此外，TLR2在其他臨床研究中也發(fā)揮重要功能。伍模鑫等[18]在24例廣東漢族人TLR2基因中鑒定到5個(gè)SNPs位點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，急性關(guān)節(jié)炎易感性的突變基因與TLR2基因顯著相關(guān)；張之宣等在9個(gè)地方雞品種，568個(gè)樣本TLR2基因中發(fā)現(xiàn)6個(gè)SNPs位點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，某位點(diǎn)突變可能與地方雞種抗病性有關(guān)。劉勝貴等[1]在豬TLR2基因中鑒定到1個(gè)SNP位點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TLR2突變位點(diǎn)可作為疾病的診斷標(biāo)記及經(jīng)濟(jì)性狀上的遺傳標(biāo)記。

本研究設(shè)計(jì)4對(duì)特異性引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增出荷斯坦牛TLR2基因，并結(jié)合DNA池技術(shù)和直接測(cè)序技術(shù)研究TLR2基因多態(tài)性。結(jié)果顯示，在TLR2基因中發(fā)現(xiàn)6個(gè)SNPs位點(diǎn)，其中G10900C、G11047C、A11076T、C12077T，均屬于同義突變，即未引起編碼氨基酸的改變，首次在第二內(nèi)含子602 bp、第2外顯子10 634 bp處發(fā)現(xiàn)T602A和T10634G，其中T10634G為錯(cuò)義突變，突變前后氨基酸發(fā)生了改變，可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)的功能發(fā)生改變，從而影響性狀的表達(dá)。對(duì)于上述突變位點(diǎn)，下一步將會(huì)通過(guò)深入研究去探討不同地區(qū)的奶牛之間的種間差異性，以精準(zhǔn)篩選出寧夏地區(qū)荷斯坦牛乳房炎抗性基因的遺傳標(biāo)記，以期能更好地為中國(guó)荷斯坦牛產(chǎn)乳量及乳品質(zhì)的提升提供理論基礎(chǔ)，更好地將分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)踐中去。

[1]劉勝貴，魏麟，史憲偉，等.豬TLR2基因Bi-PASA遺傳標(biāo)記的建立及多態(tài)性研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2007，（1）：7-9.

[2]Medzhitov R,Jr J C.An ancient system of host defense[J].Current Opinion in Immunology,1998,10(1):12-15.

[3]Muzi oM,Bosisio D,Polentarutti N,et al.Differential expression and regulation of toll-like receptors(TLR)in human leukocytes:selective expression of TLR3 in dendritic cells[J].J Immunol,2000,164(11):5998-6004.

[4]Lucas K,Maes M.Role of the Toll Like Receptor(TLR)Radical Cycle in Chronic Inflammation:Possible Treatments Targeting the TLR4 Pathway[J].Molecular Neurobiology,2013,48(1):190-204.

[5]Beutler B,Poltorak A.Beutler B,Poltorak A:Sepsis and evolution of the innate immune response[J].Critical Care Medicine,2001,29(7 Suppl):S2-6;discussion S6-7.

[6]周立華，李軍，鄒娜姝，等.TLR2和TLR4相關(guān)疾病與藥物的研究進(jìn)展[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2014，30（7）：767-770.

[7]Thomauszynski S,Stenger S,Takeuchi O,et al.Induction of Direct Antimicrobial Activity Through Mammalian Toll-Like Receptors[J].Science,2001,291(5508):1544-1547.

[8]唐深.TLR家族及其功能研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，2004，32（2）：42-45.

[9]Mcguire K,Jones M,et al.Radiation hybrid mapping of all 10 characterized bovine Toll-like receptors[J].Animal Genetics,2006,37(1):47-50.

[10]Shinohara M,Hirata K,Yamashita T,et al.Local overexpression of toll-like receptors at the vessel wall induces atherosclerotic lesion formation:synergism of TLR2 and TLR4[J].Arteriosclerosis Thrombosis&Vascular Biology,2007,27(11):2384.

[11]馬騰壑，許尚忠，王興平，等.奶牛TLR2基因遺傳變異與乳房炎體細(xì)胞評(píng)分的相關(guān)研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007，38（4）：332-336.

[12]袁崢嶸，張立敏，等.利用DNA池和測(cè)序技術(shù)快速篩查牛CACNA2D1基因SNPs[A].動(dòng)物遺傳育種學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集[C].中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)，2008：156-157．

[13]Shifman S,Pisanté-Shalom A,Yakir B,et al.Quantitative technolo-gies for allele frequency estimation of SNPs in DNA pools[J].Molecularand Cellular Probes,2002,16(6):429-434.

[14]黃智偉，黃琛.DNA檢測(cè)技術(shù)研究現(xiàn)狀[J].傳感器世界，2001，7（1）：9-14+4.

[15]李樹(shù)珍，萬(wàn)慧榮，楊光.DNA池結(jié)合DHPLC和直接測(cè)序技術(shù)在江豚SNPs檢測(cè)中的應(yīng)用[J].獸類學(xué)報(bào)，2009，29（2）：185-190.

[16]張翠霞，王洪梅，李建斌，等.荷斯坦牛TLR2基因遺傳多態(tài)性與乳腺炎抗性關(guān)系分析[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2008，23（6）：1065-1068.

[17]白杰，林嘉鵬，袁芳，等.TLR2基因多態(tài)性與奶牛體細(xì)胞評(píng)分的相關(guān)性研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，42（3）：356-362.

[18]伍模鑫，肖文娟，劉澤寰.廣東漢族人群TLR2基因的多態(tài)性研究[J].中國(guó)病理生理雜志，2010，26（12）：2373-2377.